RIG-I_NF-κB信号通路在老龄小鼠围术期神经认知障碍中的作用.pdf
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1、宁夏医科大学学报4缘卷文章编号:1674-6309(2023)08-0792-07论著收稿日期:2023-01-13基金项目:甘肃省麻醉与脑功能临床医学研究中心(21JR7RA675)作者简介:杨玉东(1983),硕士,主治医师,研究方向为围术期脑保护。通信作者:阎文军(1971),女,博士,研究方向为围术期器官功能保护。E-mail:围术期神经认知障碍(perioperative neurocog原nitive disorders,PND)是围术期严重并发症,主要表现为学习和记忆、注意力、执行功能、语言思维、知觉运动、社会认知等能力下降1-2。PND 导致术后 1耀6 个月的病死率增加,且发
2、病率高,严重影响患者的术后恢复质量,使其住院时间延长、医疗费用增加,甚至可能导致长期的认知功能障碍,但其发病机制尚未完全阐明3。研究4-5表明,由手术创伤引起的外周炎症和全身炎性介质的释放会影响中枢神经系统的炎症过程,并且这些炎性介质水平的高低与认知功能障碍的严重程度相关,尤其是在记忆和学习方面。维甲酸诱导基因 I(RIG-I)是一种 RNA 解旋酶,被认为是一种重要的细胞内模式识别受体,通过识别病毒与细菌的 RNA 和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),导致核因子 资B(nuclear factor kappa-B,NF-资B)的激活,从而发挥抗病毒和抗菌的先天免疫反应。
3、据报道6,RIG-I/NF-资B 信号通路与神经炎性反应关系密切,故其过度激活可能通过导致脑内促炎因子级联式增加,引起神经细胞损伤,从而对认知功能产生影响,但抑制该通路是否可以改善 PND 仍不明确。因此,本实验旨在探讨 RIG-I/NF-资B 信号通路在老龄小鼠 PND 中的作用及其潜在机制,为 PND 提供新的分子靶点和治疗策略。1材料与方法1.1实验动物及分组50 只 15 月龄雄性野生型 C57BL/6J 小鼠饲养于南京拉姆达医药有限公司 实验动物使用许可证编号:SYXK(苏)2021-0038,并由南京拉姆达医药有限公司实验动物伦理委员会批准(批准文号:IACUC-20220608)
4、,所有相关实验方法与RIG-I/NF-资B 信号通路在老龄小鼠围术期神经认知障碍中的作用杨玉东1,2,董东2,阎文军3(1.宁夏医科大学,银川750004;2.宁夏回族自治区人民医院麻醉科,银川750002;3.甘肃省人民医院麻醉手术科,兰州730000)摘要:目的探讨 RIG-I/NF-资B 信号通路在老龄小鼠围术期神经认知障碍(perioperative neurocognitive disor原ders,PND)发生中的作用。方法健康雄性 15 月龄野生型 C57BL/6J 小鼠 36 只,随机分为空白组(C 组)、假手术组(Sham 组)、PND 组和 RIG-I-/-+PND 组,每
5、组 9 只。PND 组和 RIG-I-/-+PND 组通过胫骨骨折髓内钉内固定手术构建老龄小鼠术后认知功能障碍模型,RIG-I-/-+PND 组海马注射 RIG-I-siRNA 干扰海马 RIG-I的表达。C 组不做任何处理,Sham 组仅麻醉后切开小腿皮肤,不做胫骨骨折处理。术后第 1、3、7 天分别通过 Morris水迷宫行为学实验评估各组的学习记忆能力、采用 RT-qPCR 法检测海马组织中 RIG-I 基因表达,Westernblot 检测 RIG-I 和 NF-资B(p65)蛋白含量,ELISA 法测定海马组织中促炎因子白细胞介素 1茁(interleukin 1茁,IL-1茁)、白
6、细胞介素 6(interleukin 6,IL-6)及肿瘤坏死因子-琢(tumor necrosis factor-琢,TNF-琢)水平。结果与Sham 组相比,PND 组小鼠在水迷宫训练潜伏期延长(P约0.001),目标象限停留时间与穿越平台次数均减少(P均约0.05)。而 RIG-I-/-+PND 组小鼠与 PND 小鼠相比,潜伏期缩短(P约0.001),目标象限停留时间和穿越平台次数均增加(P均约0.05)。相比 PND 小鼠,RIG-I-/-+PND 组小鼠 RIG-I 基因表达受到抑制(P约0.001)、RIG-I/NF-资B 信号通路中 RIG-I 和 NF-资B p65 蛋白表达
7、均减少(P均约0.05)、海马中促炎因子 IL-6、TNF-琢 和 IL-1茁 浓度均降低(P均约0.05)。结论在老龄小鼠中,RIG-I 基因沉默可以通过抑制 RIG-I/NF-资B 信号通路激活,降低神经炎症水平,从而改善手术麻醉引起的神经认知功能障碍。关键词:维甲酸诱导基因 I;NF-资B 信号通路;炎性因子;围术期神经认知障碍中图分类号:R614文献标识码:ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.08.006第 45 卷8 期2023 年 8 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University792窑窑8期操作均
8、严格遵守伦理规范。经 Morris 水迷宫实验筛选出无学习能力障碍的 36 只小鼠,于第 7 天进行分组和造模。采用随机数表法将小鼠平均分为 4 组:空白组(C 组)、假手术组(Sham 组)、PND组、RIG-I-/-+PND 组,每组 9 只。C 组不做任何处理,其他组在腹腔注射 4%水合氯醛麻醉后切开小腿皮肤,Sham 组不做胫骨骨折处理,0.9%生理盐水冲洗后逐层缝合伤口;PND 组、RIG-I-/-+PND 组进行胫骨骨折髓内钉内固定手术处理,应用利多卡因注射液镇痛后缝合。RIG-I-/-+PND 组于术前和术后第 3 天经海马注射 RIG-I-siRNAs通用生物(安徽)股份有限公
9、司,中国 各 1 次。注射时将 siRNA 以 5 nmol/20 g 的浓度溶解于RNase-free 水中,将小鼠麻醉后固定于脑立体定位仪(南京卡尔文生物科技有限公司,中国),沿颅骨中线切开皮肤,暴露颅骨并消毒后,用定位仪推进器将头皮针插入颅骨小孔下约 2 mm 处进行注射。每只小鼠注射体积为50滋L,注射时间90 s,留针时间约 30 s,注射期间保持注射管道系统的通畅及封闭。注射用 RIG-I-siRNA 序列如下:正向引物:5-GCCAUGCAACAUAUCUGUAAAdT原dT-3;反向引物:5-UUUACAGAUAUGUUG原CAUGGCdTdT-3。1.2胫骨骨折髓内钉内固定手
10、术胫骨骨折髓内钉内固定术用于建立 PND 模型7。腹腔注射 5%水合氯醛(博士德生物工程有限公司,中国)0.5 mL/100 g 麻醉小鼠。待小鼠翻正反射消失后,将其固定于手术台(瑞沃德生命科技有限公司,中国)上,备皮、使用碘伏消毒小鼠右下肢,铺巾后于右侧膝关节下切开约0.5 cm 皮肤,逐层分离,暴露胫骨。将 0.3 mm 的髓内固定针插入髌腱,充分固定后用手术钳于胫骨中上 1/3 处断裂胫骨骨干,立即使用 0.9%生理盐水冲洗后再将固定针完全插入并对合。清创后逐层缝合伤口,手术切口周围以 0.2%利多卡因胶浆局部浸润镇痛,包扎后将小鼠置于电热毯(三春电器有限公司,中国)上复苏,待其苏醒后送
11、回动物房正常饲养。手术时间约 30 min,全程无菌操作,术中室温维持在 24耀26 益,直肠温度维持 36.5耀37.5 益。1.3组织样本采集小鼠术后第 1、3、7 天 Morris 水迷宫行为学测试结束后,每组随机取 3 只小鼠麻醉后使用脊椎脱臼法处死,剥离小鼠大脑皮质,快速分离海马组织。将分离的海马组织置于培养皿中,用 1伊PBS 洗涤 3 次,以去除杂质。随后液氮速冻,-80 益保存备用8。1.4Morris 水迷宫实验Morris 水迷宫实验包括定位航行实验和空间探索实验,分别于术前和术后进行9-10。术前用于剔除学习能力异常的小鼠,术后用于评价 RIG-I基因沉默对于 PND 小
12、鼠认知能力的影响。空间认知能力差异无统计学意义的 4 组小鼠于术后第 1、3、7 天进行逃避潜伏期、目标象限停留时间及穿越平台次数测试。每次实验分别从 4 个象限的固定点将小鼠面向池壁放入,记录其找到平台的时间(逃避潜伏期),60 s 内未找到平台的潜伏期记为 60 s。定位航行实验结束后,撤掉水下平台,将小鼠从原平台对角象限面向池壁放入,记录 60 s 内其在原逃生平台所在象限的停留时间(目标象限停留时间),以及在该时间内穿越原平台位置的次数(穿越平台次数)。实验期间使用路径追踪系统采集小鼠游泳轨迹(Noulds,EthoVi原sion 14.0,荷兰)。1.5ELISA 测定海马组织炎性因
13、子含量-80 益冻存的海马组织用无菌手术剪刀剪碎,按质量(g)颐体积(mL)=1颐9 加入 1伊PBS 液,利用玻璃匀浆器将组织制成匀浆,4 益、12 000 r min-1,离心 10 min,收集上清液。采用 ELISA 试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,中国)检测术后第1、3、7 天海马组织上清液中炎性因子白细胞介素(interleukin 1茁,IL)-1茁、IL-6 以及肿瘤坏死因子-琢(tumor necrosis factor-琢,TNF-琢)水平。具体步骤按照 ELISA 试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)说明书进行操作:将样本按 1颐4 稀释后,分别加入小鼠 IL-1茁、IL
14、-6 或 TNF-琢 捕获抗体包被的固相抗体微孔板。结合后加入 HRP 酶标记抗体,最后用 TMB 显色。用多功能酶标仪(M3 公司,美国)在 450 nm 波长下测定光密度(OD)值,根据标准品梯度稀释绘制标准曲线,并根据标准曲线计算小鼠海马组织中 IL-1茁、IL-6 和 TNF-琢水平。1.6Real-time qPCR 检测小鼠海马组织 RIG-I基因表达水平按 TRIzol 试剂说明书(Invitrogen 公司,美国)操作步骤,提取海马组织中总 RNA。总 RNA在 OD 260 nm 处测定 RNA 浓度,OD 260/280 nm处检测抽提的 RNA 纯度。根据试剂盒说明书,使
15、用 cDNA 第一链合成试剂盒(TaKaRa RR036B,日本)进行反转录和 One Step TB GreenRPrime原杨玉东,等.RIG-I/NF-资B 信号通路在老龄小鼠围术期神经认知障碍中的作用793窑窑宁夏医科大学学报4缘卷ScriptTMRT-PCR Kit域(SYBR Green,TaKaRa 公司,日本)进行 cDNA 片段扩增。0.1 mL PCR 管中,依次加入如下组分混合成 20 滋L 反应体系:10 滋L2伊Real-time PCR Master Mix、1 滋L 8 倍稀释的cDNA 模板、2 滋L 引物 Mix 及 7 滋L 0.1%DEPC水。随后使用荧光
16、定量 PCR 循环仪(ABISteponeplusReal time-PCR system,美国),设置 95 益预热5 min,95 益变性 15 s、60 益退火20 s、72 益延伸30 s,共 40 次循环。RIG-I 和 GAPDH 内参引物使用 Primer 6 设计,由通用生物(安徽)股份有限公司合成,引物序列见表 1。2-驻驻Ct法用于计算基因相对表达量。表 1qPCR 引物序列名称序列(5 3)RIG-IF:GCCGAATGTCTTATCAGATCCGR:5-ATGAAAATCTGGATGCTGGACGGAPDHF:5-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCR:5-TTC
17、TCCATGGTGGTGAAGACGCCA1.7Western blot 检测小鼠海马组织 RIG-I 和NF-资B p65 的表达使用全蛋白抽提试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司,KGP250,中国)提取冻存的小鼠海马组织中的总蛋白,具体步骤按照产品说明书操作。用 BCA 蛋白含量检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司,KGP250,中国)定量蛋白浓度。蛋白加热变性后等体积上样,用十二烷基磺酸钠原聚丙烯酰胺凝胶电泳(10%分离胶、5%浓缩胶)分离蛋白后,转移至硝酸纤维素膜(nitrocellulosemembrane,NC)。NC 膜在常温下用 5%脱脂牛奶封闭 2 h 后,移入 4 益
18、分别同抗兔 RIG-I(CellSignaling Technology 公司,美国,1颐1 000)、抗兔NF-资B p65(Abcam 公司,美国,1颐1 000)或抗兔GAPDH 一抗(江苏凯基生物技术股份有限公司,中国,1颐5 000)摇床振荡孵育过夜。次日,加入对应抗兔 HRP 酶标 IgG 二抗(江苏凯基生物技术股份有限公司,中国,1颐1 000)常温孵育 2 h 后使用增强化学发光试剂显色。ChemiDoc MP ImagingSystem(Bio-rad 公司,美国)用于成像,Gel-Pro32 软件(Media Cybernetics 公司,美国)进行灰度分析。1.8统计学方
19、法数据应用 SPSS 25.0 软件进行统计分析,GraphPad Prism 9.0 软件绘制柱状图。符合正态分布的计量资料以均数依标准差(x依s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用 LSD-t检验。P臆0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1RIG-I 基因沉默改善老龄 PND 小鼠神经认知障碍老龄小鼠连续 5 d 进行定位航行训练帮助形成空间记忆后,筛选记忆功能无障碍的小鼠纳入实验。术后第 1、3、7 天分别对各组进行 Morris水迷宫空间探索实验。实验结果显示,与 Sham 组相比,术后第 7 天 PND 组老龄小鼠逃避潜伏期延长(图 1A),目标象限停留时间缩短(图1
20、B),穿越平台次数减少(图 1C)(P均约0.05),表明手术创伤可导致老龄小鼠术后围术期神经认知障碍。而 RIG-I-/-+PND 组与 PND 组相比,逃避潜伏期缩短(图 1A)、目标象限停留时间(图 1B)及穿越平台次数增加(图 1C)(P 均约0.05),该 3 项指标RIG-I-/-+PND 组和 C 组或 Sham 组间差异均无统计学意义(P均跃0.05)。提示 RIG-I 基因沉默对PND 老龄小鼠的空间记忆学习功能障碍有积极的改善作用,能使其接近于正常水平。A.逃避潜伏期;B.目标象限停留时间;C.穿越平台次数;*P0.05;*P0.01。图 1RIG-I 基因沉默后老龄 PN
21、D 小鼠的 Morris 水迷宫实验结果ABC*6040200第 1 天第 猿 天第 苑 天*40302010086420第 1 天第 猿 天第 苑 天第 1 天第 猿 天第 苑 天C 组Sham 组PND 组RIG-I-/-+PND 组C 组Sham 组PND 组RIG-I-/-+PND 组C 组Sham 组PND 组RIG-I-/-+PND 组2.2RIG-I 基因沉默对老龄 PND 小鼠海马组织中 RIG-I 基因表达水平的影响如图 2 所示,利用 RT-qPCR 检测各组小鼠海马组织中 RIG-I 基因的表达水平。结果发现,与 Sham 组相比,第 7 天 PND 组中 RIG-I 基
22、因水平更高(P0.001)。且 RIG-I 基因在 RIG-I-/-+794窑窑8期A.Western blot 检测灰度成像曝光图;B.RIG-I 蛋白的相对表达水平;C.NF-资B p65 蛋白的相对含量;*P 0.05;*P0.01。图 3Western blot 检测 RIG-I 基因沉默后 PND 小鼠海马组织中 RIG-I 与 NF-资B p65 蛋白水平的变化杨玉东,等.RIG-I/NF-资B 信号通路在老龄小鼠围术期神经认知障碍中的作用*1.00.80.60.40.20.01.00.80.60.40.20.0101 kDa65 kDa37 kDaRIG-INF-资B p65GA
23、PDHABC第 1 天第 猿 天第 苑 天第 1 天第 猿 天第 苑 天C 组Sham 组PND 组RIG-I-/-+PND 组C 组Sham 组PND 组RIG-I-/-+PND 组PND 组表达低于 PND 组,该趋势在术后第 3 天(P0.05)和第 7 天(P0.001)的检测中均得到了证实,说明 RIG-I-siRNA 注射海马可以成功沉默 PND 小鼠海马中高表达的 RIG-I 基因。C 组Sham 组PND 组RIG-I-/-+PND 组*2.01.51.00.50.0第 1 天第 猿 天第 苑 天两组间比较*P0.05;*P0.001。图 2 RT-qPCR 检测 RIG-I
24、基因沉默后 PND 小鼠海马组织中 RIG-I mRNA 表达变化2.3RIG-I 基因沉默对老龄 PND 小鼠海马组织RIG-I 与 NF-资B p65 蛋白表达的影响通过 Western blot 对 RIG-I 与 NF-资B p65蛋白进行检测,结果发现,在术后第 7 天,RIG-I 和NF-资B p65 蛋白水平在 PND 组中的表达均高于Sham 组和对照组(图 3A 和图 3B),而 RIG-I-/-+PND 组则低于 PND 组(P 均0.05),提示 PND 可能与 RIG-I/NF-资B 通路激活有关,而 RIG-I 基因沉默对 PND 小鼠的影响可能通过对该信号通路的抑制
25、来实现。2.4RIG-I 基因沉默对老龄 PND 小鼠海马组织中炎性因子水平的影响与 Sham 组相比,术后第 3 天起,PND 组小鼠海马组织中 IL-6(图 4A)、TNF-琢(图 4B)以及IL-1茁(图 4C)水平均升高(P 均0.05),而 RIG-I-/-+PND 组与 PND 组相比,IL-6、TNF-琢 及 IL-1茁 炎性因子浓度均降低(P 均0.05)。术后第 7 天的检测结果也呈现出相似的趋势,PND 组小鼠炎性因子比 Sham 组小鼠升高,而与 PND 组比较RIG-I-/-+PND 组降低(P0.05)。以上结果表明,海马注射 RIG-I-siRNA 能够改善手术后海
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