小鼠体内砷甜菜碱向无机砷的生物降解.pdf
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1、生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 3 期 2023 年 6 月Vol.18,No.3 Jun.2023 基金项目:广东省基础与应用基础研究基金自然科学基金杰出青年项目(2022B1515020030);广州大学百人计划引进人才科研启动项目(RQ2020057)第一作者:赵芊瑜(1999),女,硕士生,研究方向为生态毒理学,E-mail:qianyu_zhao_ *通信作者(Corresponding author),E-mail:zh_DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20221226001赵芊瑜,熊海燕,叶紫君,等.小
2、鼠体内砷甜菜碱向无机砷的生物降解J.生态毒理学报,2023,18(3):326-335Zhao Q Y,Xiong H Y,Ye Z J,et al.Biodegradation of arsenobetaine into inorganic arsenic in mice J.Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(3):326-335(in Chinese)小鼠体内砷甜菜碱向无机砷的生物降解赵芊瑜,熊海燕,叶紫君,黄莉萍,张伟*广州大学环境科学与工程学院,广州 510006收稿日期:2022-12-26 录用日期:2023-02-10摘要:砷在高浓度下
3、对生物体具有极高的毒性,然而,关于低毒性的砷甜菜碱(AsB)在哺乳动物体内生物转化的研究有限。AsB 对人体是否造成潜在健康影响,最近引起了广泛的关注。因此,本研究评估了 AsB 和无机砷形态在小鼠体内的差异吸收、生物转化和生物积累。为此,C57BL/6J 小鼠以1 000 g kg-1剂量口服 AsB 和无机砷(iAs)14 d。随后,收集组织/器官样本以及尿液和粪便样本进行分析。结果表明,AsB 的口服吸收率最高。此外,我们观察到 AsB 经口服后向砷酸盐(As()发生显著生物转化,相较于亚砷酸盐(As()或 As()处理的小鼠,AsB 处理小鼠的肝脏、肺和脾脏中砷积累水平更高。在短期接触
4、 AsB 后,iAs 在肺和脾脏中表现出较高的积累水平。总的来说,这些发现提供了强有力的证据,证明在哺乳动物中,AsB 经历了向 iAs 的生物转化,同时表明哺乳动物长期摄入 AsB 存在潜在的健康风险。关键词:砷甜菜碱;无机砷;老鼠;生物降解文章编号:1673-5897(2023)3-326-10 中图分类号:X171.5 文献标识码:ABiodegradation of Arsenobetaine into Inorganic Arsenic in MiceZhao Qianyu,Xiong Haiyan,Ye Zijun,Huang Liping,Zhang Wei*School of
5、Environmental Science and Engineering,Guangzhou University,Guangzhou 510006,ChinaReceived 26 December 2022 accepted 10 February 2023Abstract:At high concentrations,As is extremely toxic to living organisms,and recently,the biotransformation ofAs species,including arsenobetaine(AsB),has attracted con
6、siderable attention owing to their health effects follow-ing their ingestion.However,studies on the biotransformation of AsB in mammals are limited.Therefore,in thisstudy,our objective was to evaluate the differential absorption,biotransformation,and bioaccumulation of As spe-cies in mice.To this en
7、d,C57BL/6J mice were orally administered AsB and inorganic As(iAs)for 14 d at a doseof 1 000 g kg-1.Thereafter,tissue/organ samples as well as urine and fecal samples were collected for analysis.The results obtained showed that AsB had the highest oral absorption rate.Additionally,we observed a sign
8、ificantbiotransformation of AsB to arsenate(As()following its oral administration,and the liver,lungs,and spleen ofAsB-treated mice showed higher As accumulation levels than those of arsenite(As()-or As()-treated mice.Further,after the short-term exposure to AsB,iAs showed a relatively high accumula
9、tion level in the lungs andspleen.Overall,these findings provided strong evidence that in mammals,organic AsB undergoes biotransformation第 3 期赵芊瑜等:小鼠体内砷甜菜碱向无机砷的生物降解327 to iAs,indicating the potential health risk associated with long-term AsB intake in mammals.Keywords:arsenobetaine;inorganic arsenic
10、;mice;biodegradation 砷是环境中最普遍的有毒物质,在美国有毒物质和疾病登记署和美国环境保护局公布的危险物质优先清单中排名第一。值得注意的是,砷的毒性和致癌性在很大程度上取决于砷的化学形态1。一般来说,无机砷(iAs)包括亚砷酸盐(As()和砷酸盐(As(),比起甲基化的五价砷如一甲基砷酸盐(MMA()和二甲基砷酸盐(DMA()的毒性更大,同时 MMA()和 DMA()比砷甜菜碱(AsB)的毒性更大。据报道,AsB 和砷胆碱(AsC)被认为是毒性最小的砷形态2-3。人类可通过空气、饮用水和食物接触到砷,导致生理功能障碍和各种疾病的发生,如心血管疾病、糖尿病和多器官癌症等4。由
11、于 iAs 的高毒性和致癌性,其生物转化也受到了广泛关注5。摄入的 iAs,包括 As()和 As(),可以通过甲基化代谢,形成MMA()和 DMA()作为最终代谢产物,然后通过哺乳动物的尿液排出。然而,在哺乳动物尿液中观察到这些甲基化代谢产物的反应中间体,即一甲基砷酸(MMA()和二甲基砷酸(MMA(),其毒性比iAs 毒性更大6-7。此外,砷甲基化的机制包括随着甲基的参与,As()被还原为 As(),其中 S-腺苷蛋氨酸是主要的甲基供体,谷胱甘肽等硫醇是还原剂。以往研究发现,As3MT 和 Cyt19 在内的甲基转移酶可以参与砷甲基化的过程7。一甲基化砷和二甲基化砷的生物转化也受到了相当多
12、的关注。据报道,在小鼠盲肠匀浆存在时,MMA()可以甲基化为 DMA(),并去甲基化为As()8。除此之外,还观察到摄入的 MMA()在小鼠中比 MMA()更广泛地代谢为二甲基化砷9。人们还提出了二甲基化砷生物转化的几种机制,一些研究表明,DMA()没有去甲基化,并作为主要代谢物在人类和动物的尿液中排出,包括小鼠、大鼠、仓鼠和兔子10-11。相反,另一些研究表明,DMA()可以被还原为二甲基砷酸(DMA(),可被大鼠的红细胞有效吸收12,或去甲基化为 MMA()和 iAs,随后在 DMA()处理后的大鼠的尿液中排出13。此外,先前的一项研究表明,口服 DMA()后的小鼠,4%15%会以三甲基砷
13、氧化物(TMAO)的形式在其尿液中排出11。另一项研究显示,大鼠暴露于含有 DMA()的饮用水 14 d 后排出了含有 TMAO的粪便14。此外,暴露于 DMA()或 DMA()的大鼠和小鼠的尿液、粪便或肝脏中检测到未知的砷代谢物15-16。海产品,特别是海洋鱼类和贝类含有高浓度的AsB17-18,使其成为人类摄入 AsB 的有效途径17。一项研究表明,在兔、大鼠和小鼠中注射 AsB 后,98.5%的 AsB 在 2 d 内被排泄,此后未检测到其他形态的砷19,表明由于 AsB 具有高极性和亲水特性,因此,AsB 在啮齿类动物中的排出速率远大于其转化效率20。然而,最近的证据表明,AsB 可以
14、在人类胃肠道(GI)中被微生物转化,DMA 和 TMAO 是主要的降解产物21。同时,在喂食含 AsB 饲料的大鼠的尿液中检测到其他形式的砷,包括 TMAO、MMA、DMA、四甲基砷和 iAs22。目前,据估计,许多国家海产品中总砷(AsB90%)的浓度可能比食品中 iAs(50 ngg-1)限值高出 200 倍23。此外,关于AsB 向 iAs 降解的研究有助于增进对与 AsB 相关的潜在食品毒性和健康风险的了解。因此,有必要进一步研究 AsB 在哺乳动物体内的生物转化。因此,本研究旨在以安全剂量(ADI)反复灌胃C57BL/6J 小鼠 14 d 后,研究包括 AsB、As()和As()在内
15、的几种砷形态的生物转化。可以得到,与不同的 iAs 形态相比,AsB 的吸收、生物转化和生物积累模式存在显著差异。此外,通过对不同形态砷的单次暴露实验,可以准确分析每种砷形态的生物转化;这对评价不同形态砷的健康危害具有重要意义。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 化学药品和试剂(Chemicals and reagents)标准品、萃取液和流动相溶液使用 Milli-Q 水(18.2 M cm,IQ 7000,Millipore SAS,法国)制备。此外,总砷的标准溶液由 10 mgL-1原液(多元素校准标准 2A,安捷伦,美国)连续稀释制备,AsB、As()和
16、 As()的溶液分别由砷甜菜碱(C5H11AsO2,Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA)、亚 砷 酸 钠(NaAsO2,Sigma-Aldrich)和 砷 酸 二 氢 七 水 钠(Na2HAsO47H2O,Sigma-Aldrich)制备。实验小鼠用戊巴比妥钠(生物试剂 C11H17O3N2Na,中国上海源业生物科技有限公司)麻醉,实验动物采集的样品用 65%硝酸消化(德国默克公司)。此外,用于高效液相色谱(HPLC)的流动相化学品(柠檬酸(C6H8O7,328 生态毒理学报第 18 卷分析试剂(AR)级),1-己烷磺酸 钠(C6H13O3SNa,98%)和氢氧化钠(N
17、aOH,(AR 级)购自中国上海化学工业园区。不同砷溶液和提取物存放在高密度聚丙烯离心管中,4 冷藏待用。1.2 动物与砷暴露(Animals and arsenic exposures)雄性 C57BL/6J 小鼠(23.2 27.6 g,7 周)购自中国医学科学院实验动物研究所(CAMS)和中国北京协和医学院(PUMC)。该研究的设计和报告遵循了ARRIVE 指南(https:/arriveguidelines.org)。所有动物实验均按照国家卫生研究院实验动物护理与使用指南(第 8 版)的指导原则进行,并经广州大学动物伦理委员会批准。小鼠最初被安置在标准聚丙烯笼中(每笼 5 只),以 S
18、PF 级窝料为垫料,温度为(221),光照/黑暗周期为 12 h/12 h,相对湿度为 50%60%,不断提供食物和水。在暴露实验开始之前,小鼠需用 7 d 适应这些测试条件。垫料和饲料购自广州赛博诺生物科技有限公司。驯化 7 d 后,将 40 只小鼠随机分为对照、AsB、As()和 As()4 个处理组,2 个重复笼,每笼5 只。配制 AsB、As()、As()(Sigma-Aldrich)原液 100mg L-1,研究砷在小鼠体内的生物转化。此外,AsB、As()和 As()处理组小鼠在暴露期(14 d)内每天灌胃 10 mLkg-1相应的砷形态(计算剂量为1 000 g kg-1),对照
19、组小鼠不进行任何砷形态的处理。在整个实验期间,提供 SPF 级维持小鼠的饲料和消毒纯净水(总砷浓度低于 710-6mg L-1的检测限度)。为避免灌注过程中小鼠应激,暴露时间限制在 14 d。小鼠饲料中总砷浓度为(0.290.02)gg-1,其中 As()(0.050.01)gg-1、As()(0.180.02)gg-1、MMA(0.020.003)gg-1、DMA(0.020.01)g g-1和 AsB(0.020.008)g g-1。每天测定小鼠体质量。每天灌胃给药前采集粪便样本,解剖前禁食 24 h,确保胃空。但是,依然提供饮用水。在结束暴露后第 2 天,用 0.5%戊巴比妥钠50 mg
20、 kg-1麻醉小鼠,并进行全身灌注,以清除循环系统和小鼠器官的血液24。在灌注过程开始时采集血液样本(约1 mL)进行砷形态分析。分别采集膀胱和小肠的尿液和食糜样本进行砷形态分析(砷形态分析见 1.4 节),同时采集内脏器官/组织,包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肠(冲洗去除食物残渣)、胃(冲洗去除食物残渣)、肌肉和粪便样本,均质化进行总砷和砷形态分析。1.3 总砷含量测定(Total arsenic content determination)小鼠的总砷含量按以下程序测定25。简单地说,将组织、食糜和粪便粉末样品各取约 0.1 g,用 1mL HNO3(65%,AR 级,默克公司)在室温(2
21、2 C)下混合消化 2 h,然后在 80 C 下消化 24 h,直到混合物变得清晰。然后,通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS,Agilent 7900,东京,日本)分析样品的总砷含量。通过分析金枪鱼标准参考物质(SRM)(BCR-627,比利时吉尔标准物质与测量研究所)来评估消解方法的准确性。SRM 的总砷回收率为 97.8%(4.70.3)gg-1,参考值为(4.80.2)gg-1,n=?6)。此外,组织、食糜和粪便样品中的砷浓度均以g g-1(干质量)表示。1.4 砷形态分析(Arsenic speciation analysis)砷的形态分析如前所述,仅略作修改26。简单地说,将大约
22、 0.2 0.3 g 的组织、食糜和粪便粉末样品加入 8 mL 1%HNO3的 Xpress 反应罐(55 mL)中,然后在微波炉(CEM Mars 6,USA)中 100 C 消化 1.5 h26。接下来,将混合物转移到 15 mL 离心管中,在 90 C 下加热浓缩。随后加入 15 mL MilliQ水 2 次,浓缩至 4 mL。待冷却后,浓缩液通过 0.22m 酸化硝化纤维素过滤器(广州初林生物科技有限公司,中国)过滤至 2 mL 棕色样品瓶(安捷伦)。采用 高 效 液 相 色 谱 法(Agilent 1260 Infinity,Bblingen,德国),结合 Agilent Zobar
23、x SB-Aq 柱(含20 mmol L-1柠檬酸(C6H8O7)和 5 mmol L-11-己磺酸钠(C6H13O3S Na)的混合物为流动相(pH 为 4.3)和 ICP-MS 检测系统,测定提 取 溶 液 中 砷 形 态的含量。比较了 2 种从龙胆石斑鱼饲料中提取砷的方法(添加 AsB)。第 1 种方法是用 50%的甲醇溶液均质提取砷25,第 2 种方法是上述提取方法。2 种提取方法得到的结果均未显示 AsB 降解。此外,小鼠暴露于不同处理后,获得了心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、肠、胃和肌肉组织中 As()、As()、MMA、DMA 和AsB 的图谱。AsB 暴露处理如图 1 所示。BCR-
24、627检测 AsB 含量为(3.71 0.17)gg-1(回收率为95.1%,参考值为(3.900.22)g g-1,n=6),DMA 含?量为(1.280.19)gg-1(回收率为 85.3%,参考值为(1.500.02)gg-1,n=6)。另外 3 种 As()、?As()和 MMA()的回收率分别为 82%90%、89%94%和 87%93%。此外,柱回收率计算为不同砷形态的含量之和与使用提取溶液测定的总砷含量的比值27。回收率在 67.7%300.0%范围内变化。第 3 期赵芊瑜等:小鼠体内砷甜菜碱向无机砷的生物降解329 图 1 AsB 暴露组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、肠、胃和肌
25、肉中 As()、As()、MMA、DMA 和 AsB 对应的色谱图注:AsB 表示砷甜菜碱,MMA 表示一甲基砷,DMA 表示二甲基砷。Fig.1 Chromatograms corresponding to As(),As(),MMA,DMA,and AsB in the heart,liver,spleen,lungs,kidneys,intestine,stomach,and muscle of mice in the AsB treatment groupNote:AsB means arsenobetaine,MMA means monomethylarsonate,and DMA
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