盐碱胁迫下产ACC脱氨酶促生菌对绿豆插条生根的作用.pdf
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1、河南农业科学,2 0 2 3,52(7):52-59Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi:10.15933/ki.1004-3268.2023.07.005盐碱胁迫下产ACC脱氨酶促生菌对绿豆插条生根的作用李鑫,张美珍1,郑翘楚,刘权,黄玉兰,殷奎德1(1.黑龙江八一农垦大学农学院,黑龙江大庆16 3319;2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江大庆16 3319)摘要:盐碱胁迫使植物产生过量的乙烯,过量的乙烯会抑制植物生根,产1-氨基环丙烷1-羧酸(ACC)脱氨酶促生菌可以通过分解乙烯的直接前体ACC缓解盐碱对植物的伤害。为探讨盐碱胁迫下
2、产ACC脱氨酶促生菌对植物生根的作用,从碱草根际土中筛选耐盐碱、产ACC脱氨酶能力较强的菌株,对筛选出的菌株进行鉴定,并分析了菌株对绿豆插条生根的影响。结果表明,DQJC1、D Q JC5、D Q JC6 三个菌株产ACC脱氨酶活性分别为8.147、7.2 8 2、7.90 6 U/mg,3个菌株具有较强的耐盐碱能力,同时具有产吲哚乙酸(IAA)能力,经鉴定这3株细菌均属于假单胞菌属(Pseudomonas)。将3株促生菌接种到绿豆插条基部,结果发现,不论是在正常条件下还是盐碱胁迫条件下,绿豆插条的根长、鲜质量及发根数均不同程度增加;在盐碱胁迫条件下,接种3株菌显著下调了绿豆插条根中ACC合酶
3、及ACC氧化酶活性,DQJC1和DQJC6菌株显著下调了绿豆插条根中ACC含量。说明产ACC脱氨酶促生菌通过减少乙烯的生成有效地缓解了盐碱胁迫对绿豆插条生根的抑制。关键词:绿豆;根际促生菌;ACC脱氨酶;扦插条;盐碱胁迫中图分类号:S522Effect of ACC Deaminase-Producing Bacteria on Rooting of MungLI Xin,ZHANG Meizhen,ZHENG Qiaochu,LIU Quan,HUANG Yulan?,YIN Kuide(1.College of Agriculture,Heilongjiang Bayi Agricultu
4、ral Reclamation University,Daqing 163319,China;2.College of Life Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural Reclamation University,Daqing 163319,China)Abstract:Saline-alkali stress makes plants produce excessive ethylene,which will inhibit plant rooting,and ACC(1-amino cyclopropane 1-carb
5、oxylic acid)deaminase-producing growth-promoting bacteria canalleviate the damage of saline-alkali stress to plants by breaking down the direct precursor ACC ofethylene.In order to explore the role of ACC deaminase-producing bacteria in plant rooting undersaline-alkali stress,we screened and identif
6、ied the strains with strong saline-alkali tolerance from alkalinegrass root soil,and analyzed the effect of the strains on rooting of mung bean cuttings.The results showedthat DQJC1,DQJC5 and DQJC6 strains produced ACC deaminase with activities of 8.147,7.282 and7.906 U/mg,respectively.Three strains
7、 had strong salinity-alkalinity tolerance and IAA(indoleaceticacid)production ability,which were identified to belong to Pseudomonas.Three strains were inoculatedinto the base of mung bean cuttings,and it was found that the root length,fresh quality and root number of文献标志码:ABean Cuttings under Salin
8、e-Alkali Stress文章编号:10 0 4-32 6 8(2 0 2 3)0 7-0 0 52-0 8收稿日期:2 0 2 2-10-18基金项目:黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目(YJSCX2021-Y61);黑龙江省地方特色学科“杂粮生产与加工”项目作者简介:李鑫(1998-),女,黑龙江鹤岗人,在读硕士研究生,研究方向:寒地作物逆境生理生态。E-mail:7 6 2 40 4958 q q.c o m通信作者:殷奎德(196 4-),男,黑龙江虎林人,教授,博士,主要从事作物逆境生理研究。E-mail:y i n k u i d e 16 3.c o m第7 期mung b
9、ean cuttings were increased under normal condition and saline-alkali stress condition.Undersaline-alkali stress,the three strains significantly down-regulated the activities of ACC synthase and ACCoxidase in mung bean cutting roots,and the DQJC1 and DQJC6 strains significantly down-regulated theACC
10、content in mung bean cutting roots,indicating that ACC deaminase-producing bacteria effectivelyalleviated the inhibition of saline-alkali stress on the rooting by reducing the production of ethylene.Key words:Mung bean;Rhizosphere promoting bacteria;ACC deaminase;Cuttings;Saline-alkali stress土壤盐碱化是目
11、前农业面临的主要问题之一。到2 0 50 年,预计超过50%的耕地将受到土壤盐碱化的影响。盐碱胁迫是导致作物减产的主要原因之一2 。土壤中的高浓度盐和高pH值会引发渗透胁迫、离子胁迫和氧化胁迫,从而影响植物生产力。由于土壤的高渗条件,植物细胞内会积累有毒离子,影响水分平衡和离子稳态3。盐碱胁迫的另一个后果是产生活性氧(ROS),活性氧会导致二次DNA损伤,如碱基缺失、DNA-蛋白质交联和双链DNA断裂4。除此之外,盐碱胁迫还可以诱导植物产生过量的乙烯,抑制叶片生长、细胞分裂和根伸长,导致植物提前衰老或死亡5。近年来,通过接种植物根际促生菌(PGPR)来帮助植物抵御盐碱胁迫逐渐成为研究热点。多项
12、研究表明,PGPR可以参与诱导植物提高抗氧化水平、调节Na*流出、提高光合效率等多种植物生理活动来缓解盐碱胁迫给植物带来的伤害6-8 。PGPR通常具有多种促生功能,如固氮、产铁载体、溶磷、产植物激素如吲哚乙酸(IAA)和合成1-氨基环丙烷1-羧酸(ACC)脱氨酶等9)。ACC脱氨酶产生菌可以将乙烯前体ACC分解成-酮丁酸盐和氨,降低植物根内的乙烯浓度,从而缓解胁迫乙烯对植物生长的不利影响10-1。另外,有研究表明,接种产ACC脱氨酶的PGPR也可以通过调节植物根中ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)的活性降低乙烯对植物的伤害2 。ACS和ACO在植物乙烯的合成过程中起重要作用,AC
13、S是植物内源乙烯合成的限速酶,ACO则是组成型的,不构成乙烯生物合成的限速酶3。目前,关于产ACC脱氨酶的PGPR促进盐碱胁迫下绿豆生长的研究已有报道14-15,其主要关注的是绿豆植株地上部分的变化,对根系的研究较少,特别是接种产ACC脱氨酶的促生菌后绿豆生根与乙烯合成相关酶的研究还未见报道。鉴于此,将产ACC脱氨酶的促生菌接种到绿豆插条基部,通过检测绿豆插条在盐碱胁迫条件下的生根数及根中ACC含量以及ACC合成酶和ACC氧化酶活性,明确李鑫等:盐碱胁迫下产ACC脱酶促生菌对绿豆插条生根的作用耐盐碱能力的研究提供参考。1材料和方法1.1材料供试土壤样品采自大庆市盐碱草原碱草根际,用以筛选产AC
14、C脱氨酶促生菌;绿豆种子为国家杂粮工程技术中心赠送,品种为小明绿。1.2方法1.2.1产ACC脱氨酶菌株的筛选及其产ACC脱氨酶能力检测产ACC脱氨酶菌株筛选参照PENROSE等16 和张国壮等17 的方法。产ACC脱氨酶能力检测具体步骤参考黄天姿等18 的方法。蛋白质含量测定选用考马斯亮蓝法。酶活的计算方式以每分钟产出1mol-丁酮酸的量为1个酶活力单位(U),计算方式参考姬文秀等19 的方法。1.2.2菌株耐盐碱范围测定耐碱试验:将筛选出的菌株按1%的接种量分别接种到pH值为8、9、10、11的LB液体培养基中,于2 8、17 0 r/min振荡培养24h,检测OD6oo值。耐盐碱试验:根
15、据耐碱试验中测定的OD6o值选择菌株生长较好的最高pH值,按1%的接种量分别接种到NaCl含量为0、2%、4%、6%、8%、10%、12%的LB液体培养基中,于2 8、170r/min振荡培养2 4h,测定OD6o0值。1.2.3菌株生理生化鉴定和分子鉴定菌株的生理生化鉴定参考微生物学实验2 0 和常见细菌系统鉴定手册2 1上有关细菌的生理生化鉴定部分,主要包括甲基红试验、唯一碳源试验、唯一氮源试验、革兰氏染色、需氧性试验、接触酶试验、氧化酶试验、硝酸盐还原试验。同时检测菌株产植物激素IAA功能,参照常慧萍等2 2 与王西祥等2 3 的方法进行。将菌株样品送至吉林美吉生物公司进行16 SrDN
16、A测序,测序结果在NCBI上进行BLAST比对,并从NCBI上找到相应模式菌株的16 SrDNA序列,之后利用MEGA7软件构建系统发育树,确定其种53产ACC脱氨酶的PGPR对盐碱胁迫条件下绿豆插条生根的作用机制,为PGPR促进植物生根、提高植物54属关系。菌株acdS基因鉴定参考秦媛等2 4 的方法,用引物acdSf3/acdSr4扩增菌株acdS基因片段,acdSf3和acdSr4的序列分别为ATCGGCGGCATCCAGWSNAA-YCANAC和 GGCACGCCGCCCARRTGNRCRTA,片段大小为7 6 0 bp,退火温度为58。1.2.4绿豆插条下胚轴不定根促生试验养:参考龚
17、月桦等2 5 的方法培养绿豆插条,绿豆种子用无菌水清洗3次后37 催芽,发芽后种植于已灭菌的蛭石中,待幼苗长至7 9 cm时,切除子叶以下5cm部位,得扦插条。最适盐碱胁迫浓度筛选:将绿豆插条分别置于0、10、14、16、18 m m o l/LNa H C O,溶液中,7 d后统计不定根数目。最适菌液处理浓度筛选:将3株促生菌接种在TSB培养基中,2 8、18 0 r/min培养2 4h,4、18 0 0 0 r/m in 离心5min,去上清后用ADF培养基重悬,再培养2 4h,诱导菌株产ACC脱氨酶活性,18000r/min离心5min,去上清后用无菌水重悬,将重悬后的菌液分别稀释到10
18、、10 7、10 cfu/L。将3种不同浓度的菌液置于10 mL灭菌离心管中,将绿豆插条下胚轴部分分别置于3种浓度的菌液中,每个离心管放5根绿豆插条,2 4h后转入无菌水中,7 d后统计不定根数目。插条处理及生根统计:将绿豆插条的下胚轴分别置于无菌水(CK)或菌悬液中浸泡2 4h,浸没插条底部2 cm。处理2 4h后,将绿豆插条分别转移至无菌水(正常条件)或NaHCO,溶液(盐碱胁迫)中,每个处理5株插条,3次重复,每隔2 4h更换无菌水或NaHCO,溶液,7 d后统计扦插条大于1mm的不定根数目,并称量根鲜质量,采用SPSS18.0进行统计分析,Origin8.5作图。将新生根剪下来用液氮速
19、冻,转至-8 0 保存,用于检测ACC含量、ACC合成酶活性和ACC氧化酶活性。插条根中ACC含量、ACC合成酶、ACC氧化酶检测:利用气相色谱法检测ACC含量、ACC合成酶活性、ACC氧化酶活性。气相色谱仪型号为北分瑞利342 0 A,进样口温度6 0,检测器温度150,柱温箱温度6 0,待仪器3个温度都达到设定值,进行仪器点火,开始监控基线,待基线平稳30 min后,开始进样。根据公式计算ACC含量、ACC成合酶活性、ACC氧化酶活性,ACC含量计算公式为N/SxCxnxVx1/22.4W,单位nmol/g;A CC合成酶活性和ACC氧化酶活性在不同前处理下计算公式均为N/SxnxVx1/
20、tx1/22.4W,单位为nmol/(hg)。式中,N为样本河南农业科学乙烯的峰面积;S为标准乙烯的峰面积;n为提取液的稀释倍数;C为标准乙烯的浓度;V为反应容器体积;W为测试样本的鲜质量;t为密闭时间。2结果与分析2.1产ACC脱氨酶促生菌的筛选及鉴定验插条培用ADF固体培养基从大庆碱草植物根际土中定性分离出了30 株具有产ACC脱氨酶能力的促生菌,编号DQJC1一DQJC30,从中选取3株产ACC脱氨酶能力较强的菌株DQJC1、D Q JC5、D Q JC6 作为后续试验的供试菌株,3株菌产ACC脱氨酶能力分别为8.147、7.2 8 2、7.90 6 U/mg。对3株菌进行耐盐碱能力鉴定
21、,发现3株菌均能在pH值11且NaCl含量10%的LB培养基中生长,均具有较强的耐盐碱能力。定量检测了DQJC1、D Q JC5、D Q JC6 的产IAA能力,分别为6 4.33、10.45、12.0 5mg/mL。对3株产ACC脱氨酶的促生菌进行生理生化鉴定,结果表明,3株促生菌均为革兰氏阴性菌,都可以利用唯一碳源(葡萄糖、蔗糖),都是需氧性菌;接触酶、氧化酶、硝酸盐还原均为阳性,DQJC1和DQJC6甲基红试验呈阳性,DQJC5甲基红试验呈阴性。acdS基因是产生ACC脱氨酶的特有基因。提取DQJC1、D Q JC5、D Q JC6 三个菌株的DNA,用引物acdSf3/acdSr4进行
22、PCR扩增,PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,3株菌在片段大小为7 6 0 bp处皆有条带,说明3株菌均具有acds基因,进一步验证了3株菌均具有产ACC脱氨酶能力。将DQJC1、DQJC5、D Q JC6 的16 SrDNA测序结果与NCBI数据库比对,结果见表1,综合菌株的生理生化鉴定和分子鉴定结果,确定3株菌为假单胞菌属(Ps e u d o m o n a s)的不同菌种,3株促生菌的系统发育分析情况见图1。2.2价筛选菌株对绿豆插条下胚轴不定根的促生作用2.2.1最适盐碱胁迫浓度筛选为了筛选绿豆插条在盐碱条件下能够生长的最高胁迫浓度,将绿豆插条分别置于0、10、12、14、16、18
23、 mmol/LNaHCO3溶液中生长,7 d后统计不定根数目。结果表明,绿豆插条在无菌水中可以正常生根,在10 16 mmol/LNaHCO,溶液中生根受到明显抑制,其中14mmol/LNaHCO,溶液抑制生根效果较强,插条平均生根数为4.10 条,在16 mmol/LNaHCO,溶液中绿豆插条几乎不再生根,因此选择14mmol/L的NaHCO,溶液作第52 卷第7 期为绿豆插条生根的盐碱胁迫浓度。表1DQJC1、D Q JC5、D Q JC6 的16 SrDNA基本信息与核酸序列比对(BLASTn)结果Tab.1 The 16S rDNA basic information and resu
24、lts nucleic acid sequence alignment(BLASTn)of DQJC1,DQJC5,and菌株StrainDQJC1DQJC5DQJC62.2.2最适菌液处理浓度筛选将不同浓度的DQJC1、D Q JC5、D Q JC6 接种到绿豆插条基部,处理后发现,3株促生菌皆在10 cfu/mL时促生效果最好,当接种菌液浓度为10 cfu/mL时,绿豆插条新生根根长有所增加,但发根数明显减少,因此,后续试验菌液处理浓度选择10 cfu/mL。2.2.3盐碱胁迫下接种3株菌对绿豆插条生根的影响将接种促生菌后的绿豆插条分别经无菌水(正常条件)和14mmol/LNaHCO,溶液
25、(盐碱胁迫)处理7d,绿豆插条发根情况分别见图2、图3及表2,盐碱李鑫等:盐碱胁迫下产ACC脱氨酶促生菌对绿豆插条生根的作用模式菌株TypestrainPseudomonasfrederiksbergensisPseudomonas vancouverensisPseudomonas brassicacearum9010080图1菌株DQJC1、D Q JC5、D Q JC6 基于16 SrDNA构建的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree constructed from strains DQJC1,DQJC5,and DQJC6 based on 16S rDNA55DQ
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