三江黄牛Prdm9域序列特征的初步研究_黄玉连.pdf
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1、中国牛业科学 2023,49(1):13-16China Cattle Science科学试验三江黄牛 Prdm9 域序列特征的初步研究黄玉连1,马晓琴2,黄林1,金素钰1,郑玉才1*(1 西南民族大学畜牧兽医学院,成都 610041;2 四川省畜牧科学研究院,成都 610066)摘要:目的 研究旨在分析三江黄牛 Prdm9 锌指域序列特征。方法 实验选用三江黄牛(n=14),通过 PC 扩增其 Prdm9 基因锌指域后进行克隆测序。结果 结果显示,三江黄牛 Prdm9 锌指域中存在 14 种锌指,它们共构成 9 种锌指域(等位基因),其中 1 种锌指和 4种锌指域在牛属动物上未见报道。各锌指
2、间有 1 5 个氨基酸的差异,发生在 6 个位点,其中 5 个为正向选择位点。结论 三江黄牛 Prdm9 锌指域的有效等位基因数、基因杂合度、多态性高,具有丰富的遗传多样性。并且通过 Prdm9 锌指域的分析比较,从一定层面上提示了三江黄牛可能与瘤牛间存在亲缘关系。关键词:三江黄牛;Prdm9;锌指;遗传多态性中图分类号:S823 8+1文献标识码:A文章编号:1001-9111(2023)01-0013-04收稿日期:2022-09-24修回日期:2022-11-26作者简介:黄玉连(1999),女,硕士研究生,主要从事分子遗传学研究。*通讯作者:郑玉才(1965),男,教授,博士,主要从事
3、高原动物生物化学与分子遗传研究。Prdm9(P domain containing 9)是一种具有甲基转移酶活性的锌指蛋白,能催化组蛋白 H3 的 4号赖氨酸(H3K4)三甲基化,在许多哺乳动物中决定重组热点的位置1-3,因此在进化中发挥十分关键的作用。Prdm9 由 3 个结构域组成,其 C 端区域包括数量不一的串联锌指2。Prdm9 基因显示高度多样性和快速进化,在人类、黑猩猩和小鼠等多种脊椎动物中都有报道4-7。牛属动物 Prdm9 基因的锌指域主要包含 5 9 个锌指8-9。三江黄牛是中国牛品种志中重要的牛品种资源,主产区在四川省汶川县,目前濒临灭绝,仅存2 000多头10。三江黄牛具
4、有体型大、适应能力和抗病力强、繁殖性能好等特点11。有研究根据父系和母系遗传分析(分别利用 ZFY 和 cytb 基因序列),表明三江黄牛与瘤牛、大额牛和野牛有较近血缘关系,遗传相似性高,认为三江黄牛可能属瘤牛种10。由于 Prdm9 进化快,且具有高度多态性,是已知的唯一的物种形成基因4,本研究以此为切入点,通过 PC 特异性扩增三江黄牛的 Prdm9 锌指域后进行克隆测序,为研究三江黄牛的遗传进化提供新数据。1材料与方法1 1样品的采集与处理14 头成年健康三江黄牛(13 母,1 公)的血液采于四川省阿坝藏族羌族自治州汶川县三江镇,颈静脉采血于含 EDTA 抗凝管中,在冰盒中 12 h 内
5、送回实验室并保存于-80。试验牛个体间无亲缘关系。1 2主要试剂与仪器WPA Biowave 核酸蛋白检测仪(Biochrom,英国),梯度 PC 仪(Eppendorf,德国),Versa Doc1000凝胶成像系统(Bio-ad,美国),DNeasy Blood Tis-sue Kit(QIAGEN,德国)和 Omega D6492 Cycle PureKit(OMEGA,美国)。1 3基因组 DNA 的提取将三江黄牛的抗凝全血用 DNeasy Blood Tis-sue Kit 提取出基因组 DNA,用核酸蛋白检测仪测定质量,20 保存。1 4三江黄牛 Prdm9 基因锌指域的扩增及测序
6、采用常规 PC 法扩增三江黄牛 Prdm9 锌指域序列,引物序列参考相关文献 8,具体为,Prdm9 F:5 CCAGCACAAGCCAGAAACCGAATC 3,Prdm9 :5 TGTCTTAGTTGCAGCATGTGGGAGC3,预期片段约 800 bp。PC 体系(25 L):2 Long Taq MasterMix 12 5 L,上、下游引物(10 mol/L)各 1 L,基因组 DNA 2 5 L,超纯水 8 0 L。PC 条件:95 3 5 min;95 30 s;67 30 s;722 5 min,34 个循环;72 5 min。用1 5%琼脂糖凝胶电泳分离 PC 产物,用 C
7、ycle Pure Kit PC 纯化试剂盒回收目标条带,再使用常规分子克隆技术进行目的片段的克隆,包括连接 PMD19 T 载体、转化DH5 感受态细胞等过程,经菌落 PC 法鉴定阳性克隆后,每个样品取 3 个阳性克隆菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司进行正向测序。1 5数据处理Prdm9 基因测序结果使用 DNAMAN 软件进行分析,并统计锌指的种类及数量等;用 PAML4 9j 软件检测序列中的正向选择位点;计算 Prdm9 锌指域的基因型频率和等位基因频率;用 GenAlex v6 502软件计算 Prdm9 锌指域的有效等位基因数(numberof effective allel
8、es,Ne)、期望杂合度(expected het-erozygosity,He)、观察杂合度(observed heterozygosi-ty,Ho),并进行哈代温伯格平衡分析;用 Cervus30 7 软件计算 Prdm9 锌指域的多态信息含量(poly-morphism information content,PIC)。2结果与分析21三江黄牛 Prdm9 基因锌指域的 PC 扩增及测序三江黄牛(n=14)的 Prdm9 基因锌指域的 PC产物在琼脂糖凝胶上呈现出一条带(n=7)或两条带(n=7),结果见图 1。经克隆测序后获得 4 种不同大小的 Prdm9 锌指结构域,长度分别为 82
9、2 bp、906 bp、990 bp 和 1 074 bp,依次含 5、6、7 和 8 个锌指。图 1三江黄牛 Prdm9 基因锌指域序列 PC 产物琼脂糖凝胶电泳2 2三江黄牛 Prdm9 基因锌指序列和锌指域的结构将测序结果推导成氨基酸序列后可知,三江黄牛 Prdm9 蛋白包含若干串联的 C2H2型锌指,每个锌指由 28 个氨基酸组成,前面有相同的保守接头序列“TGEKPYV”。在试验三江黄牛的 Prdm9 中共检测到 14 种锌指(图 2),各锌指间有 1 5 个氨基酸的差异,出现在 6 个位点,分别为 5、2、1、+2、+3 和+6。经 PAML4 9j 软件分析,除了+6 位点外,其
10、他 5 个均为正向选择位点。与已报道的牛属动物 Prdm9 锌指相比8-9,12,本研究发现的锌指 10尚未见报道。注:1 14 为不同的 Prdm9 锌指,每个锌指含 28 个氨基酸;6 个氨基酸变异位点在锌指序列的 5、2、1、+2、+3、+6 处(位置编号相对于 螺旋的起点,其左边为 ,右边为+),其中为正向选择位点。图 2三江黄牛 Prdm9 的 14 种锌指序列测序结果显示,在试验三江黄牛中有 9 种不同的 Prdm9 锌指域,每种锌指域包含4 6 种不同的串联锌指(图 3),锌指数量为 5、6、7、8 个,其中含 6 个锌指的锌指域有 4 种类型(ZFD2 ZFD5)。含 7 个锌
11、指的锌指域有 3 种类型(ZFD6 ZFD8),且均以杂合型(5+7 个锌指或 6+7 个锌指)存在于个体中。不同的锌指在锌指域中出现的频率也有差异,其中锌指 7 出现的频率最高。与已报道的牛属动物中的 Prdm9 锌指域相比8-9,12,本研究发现了 4 种新的锌指域,包括 ZFD3、ZFD5、ZFD7 和 ZFD8。ZF1 ZF8 为锌指串联顺序。ZFD1 ZFD9 为包含5 8 个锌指的共 9 种锌指域结构,各锌指的序列见图 2。图 3三江黄牛 Prdm9 锌指域结构示意图2 3三江黄牛锌指域的多态性分析将三江黄牛的9 种 Prdm9 锌指域(图3 中 ZFD1 ZFD9)分别定义为 A
12、 I 等位基因,共显示 11 种基因型(表 1),DD 为优势基因型,D 为优势等位基因并存在于 6 头牛中。由表 1 可以看出,试验三江黄牛个体的 Prdm9 锌指域有一半都是以杂合型存在的,包括 AF、AI、BF、CG、DF、DH 和 DI。41中国牛业科学第 49 卷根据表1 计算三江黄牛 Prdm9 锌指域的遗传参数,Ne 为 5 681,Ho 为 0 500,He 为 0 824,PIC 为0 805。三江黄牛 Prdm9 锌指域的等位基因频率分布极显著偏离哈代温伯格平衡(P 0 01)。表 1三江黄牛 Prdm9 锌指域的基因型频率和等位基因频率基因型 数量基因型频率 等位基因 数
13、量 等位基因频率AF10 0714A20 0769AI10 0714B30 1154BB10 0714C10 0385BF10 0714D90 3462CG10 0714E20 0769DD30 2143F30 1154DF10 0714G10 0385DH10 0714H10 0385DI10 0714I40 1539EE20 1429II10 0714注:A I 依次对应锌指域 ZFD1 ZFD9。3讨论Prdm9 基因是迄今为止在哺乳动物中发现的唯一的物种形成基因13。三江黄牛 Prdm9 的锌指域结构与其他的哺乳动物相同,都为串联的 C2H2型锌指12。本研究检测到三江黄牛的锌指重复为
14、 58 个。Prdm9 锌指数在不同的物种间有所差异,例如,马属动物中锌指数为 5 14 个14,野生小鼠中为 7 17 个15,黑猩猩和倭黑猩猩为 7 17个6。在牛属动物中,普通黄牛 Prdm9 锌指数为 5 7 个8,16,牦牛为 5 6 个8,12,水牛为 7 9个12,瘤牛为 6 8 个12。本研究中三江黄牛个体Prdm9 锌指数均在牛属动物的范围内。牛属动物中已报道的 Prdm9 锌指序列有 59 种,锌指域有 41种12,16,本研究发现了在牛属动物中还未报道的 1种 Prdm9 锌指(锌指 10)和 4 种锌指域(ZFD3、ZFD5、ZFD7 和 ZFD8),新的锌指在 1 位
15、点发生突变(由 Q 突变为 L),这在其他物种中也未见,本研究结果丰富了有关牛的 Prdm9 基因锌指和锌指域的研究资料。有研究表明三江黄牛可能属于瘤牛10,是原产于四川省阿坝藏族自治州的优良品种。张桂香等推测四川和云南等地区可能是中国瘤牛的发源地之一17,张成忠等通过分析四川黄牛染色体带型和血液蛋白多态性等,认为四川黄牛也属于瘤牛种18,本研究检测到的三江黄牛锌指域 ZFD9(图 3)与瘤牛中检测到的一种含有8 个锌指的 Prdm9 锌指域完全相同,在一定程度上提示二者间的亲缘关系。宋卫涛利用微卫星 DNA 标记评估部分中国南方黄牛遗传多样性,其中三江黄牛的 12 个微卫星座位的平均有效等位
16、基因数为 5 61 个,平均杂合度为0 737,平均多态信息含量为 0 696,显示其具有丰富遗传多样性和较高的遗传变异19,并且在南方黄牛品种中微卫星 DNA 座位的哈代温伯格平衡在半数群体中处于不平衡状态,分析发生不平衡的因素可能为迁移、突变或一些保育措施。本研究中三江黄牛 Prdm9 基因的有效等位基因数为 5 681,期望杂合度为 0 824,观察杂合度为 0 500,多态信息含量为 0 805,为高度多态水平(PIC 0 05),提示三江黄牛具有丰富的遗传多样性。本研究结果与微卫星 DNA 标记法得到的结果类似,说明可以通过Prdm9 基因锌指序列分析来获得与微卫星 DNA 标记法类
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