大承气汤用于过敏性哮喘对MAPK信号通路和Th1_Th2型细胞因子影响的动物模型研究.pdf
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1、1204 2023 年 10 月第 43 卷第 10 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Oct.2023 Vol.43 No.10 DOI:10.13463/ki.jlzyy.2023.10.020大承气汤用于过敏性哮喘对 MAPK 信号通路和 Th1/Th2 型细胞因子影响的动物模型研究尹志鹏,张 全,谭 俊,雷明盛*(湖南省张家界市人民医院 呼吸与危重症医学科,湖南 张家界 427000)摘要:目的 研究大承气汤用于过敏性哮喘小鼠对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路和辅助性 T 细胞(Th)1/Th2型细胞因子影响。方法 40只BALB/c小鼠通过
2、随机数字表法分为空白对照组(A组)、模型组(B组)、地塞米松组(C 组)和大承气汤组(D 组),每组各 10 只。通过卵清白蛋白(OVA)致敏激发构建过敏性哮喘小鼠模型,分别在第 0 天、第 14 天致敏,第 21 27 天进行 OVA 雾化激发,C 组及 D 组在雾化前 1 h 分别给予地塞米松及大承气汤干预,A组小鼠给予生理盐水处理。第28天实验结束,取肺组织及气管肺泡灌洗液(BALF),计算四组肺指数,检测四组BALF中细胞总数及各类炎症细胞(嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞)数目,检测MAPK信号通路蛋白p38蛋白激酶(p38 MAPK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、p-
3、p38 MAPK、p-ERK1/2表达水平,检测 4 组 BALF 炎症细胞因子 人干扰素-(INF-)、白细胞介素(IL)-4、IL-5、IL-17A 水平。结果 肺指数水平:A组D组C组B组(P0.05)。BALF中总细胞数水平:A组C组D组B组(P0.05);嗜酸性粒细胞水平:A 组 C 组 D 组 B 组(P 0.05);中性粒细胞水平:A 组 C 组 D 组 B组(P 0.05);淋巴细胞水平:A 组 C 组 D 组 B 组(P 0.05);巨噬细胞水平:A 组 B 组 D 组C 组(P 0.05)。以-actin 为内参对照,p-p38/-actin 水平:A 组 C 组 B 组(
4、P 0.05),C 组 D 组 B组(P0.05),A组D组(P0.05);p38/-actin水平:A组C组D组B组(P0.05);p-ERK1/2/-actin水平:A 组 C 组 D 组 B 组(P 0.05);ERK1/2/-actin 水平:A 组 C 组 D 组 B 组(P 0.05)。INF-水平:A 组 C 组 D 组 B 组(P 0.05);IL-4 水平:A 组 C 组 D 组 B 组(P 0.05);IL-5水平:A组C组B组(P0.05),A组D组(P0.05),C组D组(P0.05),B组D组(P0.05);IL-17A 水平:A 组 C 组 D 组 B 组(P 0.
5、05)。结论 大承气汤可有效减轻过敏性哮喘小鼠炎症水平,其可能与抑制 MAPK 信号通路中磷酸化蛋白质表达及调节 Th1/Th2 平衡有关。关键词:过敏性哮喘;大承气汤;丝裂原活化蛋白激酶;辅助性 T 细胞 中图分类号:R562.2 文献标志码:A 文章编号:1003-5699(2023)10-1204-05Study on the effect of Dachengqi decoction on MAPK signaling pathway and Th1/Th2 Study on the effect of Dachengqi decoction on MAPK signaling pat
6、hway and Th1/Th2 cytokines in animal model of allergic asthmacytokines in animal model of allergic asthmaYIN Zhipeng,ZHANG Quan,TAN Jun,LEI Mingsheng*(Department of Respiratory and Critical Care Medicine,Zhangjiajie Peoples Hospital,Zhangjiajie 427000,China)Abstract:ObjectiveAbstract:Objective To st
7、udy the effects of Dachengqi decoction on the mitogen activated protein kinase(MAPK)signal pathway and helper T cell(Th)1/Th2 cytokines in mice with allergic asthma.MethodsMethods Forty BALB/c mice were randomly divided into a blank control group(group A),a model group(group B),a dexamethasone group
8、(group 作者简介:尹志鹏(1977),男,主任医师,主要从事哮喘、COPD、呼吸肿瘤等临床研究*通信作者:雷明盛,电子信箱-mingshenglei_1205 2023 年 10 月第 43 卷第 10 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Oct.2023 Vol.43 No.10 C)and a Dachengqi decoction group(group D),with 10 mice in each group.A mouse model of allergic asthma was established by an ovalbumin(OV
9、A)sensitization challenge.The sensitization was carried out on day 0 and 14th respectively,and the OVA aerosol challenge was carried out on days 21st-27th,and group C and D were treated with dexamethasone and Dachengqi decoction one hour before atomization,while group A was treated with normal salin
10、e.At the end of the experiment on the 28th day,the lung tissue and bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were taken to calculate the lung index of the four groups,to detect the total number of cells and the number of various inflammatory cells(eosinophils,neutrophils,lymphocytes,macrophages)in the four
11、groups of BALF,to measure the expression levels of MAPK signal pathway proteins p38 protein kinase(p38 MAPK),extracellular regulated protein kinase(ERK),p-p38 MAPK,p-ERK1/2,and to detect the levels of BALF inflammatory cytokines human interferon-(INF-),interleukin(IL)-4,IL-5,IL-17A in the four group
12、s.ResultsResults Lung index level:Group Agroup Dgroup Cgroup B(P0.05).The total number of cells in BALF:Group Agroup Cgroup Dgroup B(P0.05);Eosinophil level:Group Agroup Cgroup Dgroup B(P0.05);Neutrophil level:Group Agroup Cgroup Dgroup B(P0.05);Lymphocyte level:Group Agroup Cgroup Dgroup B(Pgroup B
13、group Dgroup C(P0.05).With-actin as the internal reference control,p-p38/-actin level:Group A=group Cgroup B(P0.05),group C=group Dgroup B(P0.05),group Agroup D(P0.05);p-ERK1/2/-actin level:Group Agroup Cgroup Dgroup B(P0.05).INF-level:Group Agroup Cgroup Dgroup B(P0.05);IL-4 level:Group Agroup Cgro
14、up Dgroup B(P0.05);IL-5 level:Group Agroup Cgroup B(P0.05),group Agroup D(P0.05),group B=group D(P0.05);IL-17A level:Group Agroup Cgroup Dgroup B(P0.05).ConclusionConclusion Dachengqi decoction can effectively reduce the inflammatory level of allergic asthma mice,which may be related to inhibiting t
15、he expression of phosphorylated proteins in the MAPK signal pathway and regulating the balance of Th1/Th2.Keywords:Keywords:allergic asthma;Dachengqi decoction;mitogen activated protein kinase;helper T cell 哮喘是一种患病人数较多的呼吸系统疾病,其典型特征是患者气道存在慢性炎症及高反应性1。西医对其的治疗主要是给予糖皮质激素进行抗炎、2 受体激动剂舒张支气管等2。大承气汤最早记载于伤寒论中,
16、为“肺肠同治”典型药方,有通腑泄热、峻下热结等效,以往常用于治疗胰腺炎、肠梗阻等病症3。有研究报道,大承气汤能够改善呼吸窘迫综合征等肺系疾病患者肺部损伤,并减轻其炎症反应,改善患者免疫功能4-5。目前关于大承气汤用于过敏性哮喘的研究较少,其治疗过敏性哮喘的作用机制也缺乏理论依据支持。有研究报道,辅助性 T 细胞(Th)1/Th2 比例失衡在哮喘发作中有重要地位;同时,有研究显示,p38 蛋白激酶(p38 MAPK)通过调控白细胞介素(IL)-4 等细胞因子参与到炎症反应中,由此推测大承气汤治疗过敏性哮喘、减轻炎症反应可能与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)与Th1/Th2平衡有关6-7。本次研究对
17、过敏性哮喘小鼠应用大承气汤,观察大承气汤对 MAPK 信号通路和 Th1/Th2 的影响,以探讨大承气汤治疗过敏性哮喘的机制,为临床治疗提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 动物 BALB/c 小鼠 40 只,6 8 周龄,体质量 20 25 g,恒温恒湿,自由食水。1.1.2 药物、试剂与仪器 美国 Sigma 公司生产,卵清白蛋白(OVA),四甲基乙二胺(TEMED),十二烷基硫酸钠(SDS)十二烷基硫酸,批号依次是 SLBM7240V,T9281,L3771;地塞米松片(福州海王福药制药有限公司,国药准字 H35021170);美国 Thermo 公司生产,BCA 蛋白测定
18、试剂盒,广谱彩虹预染低蛋白 Marker,氢氧化铝凝胶,批号依次是 A53225,26628,R1235952B;美国 CST 公司生产,磷酸化(p)-MAPK 单克隆抗体,MAPK 单克隆抗体,批号依次是 9910,9926;美国 Abgent 公司生产,羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G-辣根过氧化物酶(HRP)二抗,-肌动蛋白(-actin)抗体,批号1206 2023 年 10 月第 43 卷第 10 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Oct.2023 Vol.43 No.10 分别为 ASS1007,AM1021B;Bio legend 公司生产,IL
19、-4 ELISA Kit、IL-17A ELISA Kit、INF-ELISA Kit,批号分别为 B187236、B181929、B1887025;深圳达科生物技术公司生产,mIL-5 检测试剂盒;迪夫快速染液,批号为 L9210789。显微镜(美国 Olympus 公司,型号 TH4-200),石蜡切片机(德国 Microm 公司,型号 HM325),1703930 型湿转电转印仪、数码凝胶成像系统(美国 Bio-Rad 公司),高速离心机(德国Eppendorf公司,型号5415),酶标仪(瑞士Tecan公司)。1.1.3 大承气汤的制备 大承气汤药方组成:大黄、枳实各12 g,厚朴24
20、 g,芒硝9 g,药物浸泡30 min后,武火煎煮 10 min,再以文火煎煮 20 min,煎煮 2 次,将所得药液混合,水煎浓缩含生药 1.9 g/mL,通过双层纱布滤过药液,分装储存于 4冰箱。1.2 方法1.2.1 动物模型的构建与给药 小鼠适应性饲养 7 d后,通过随机数字表法将小鼠分为空白对照组(A组)、模型组(B 组)、地塞米松组(C 组)和大承气汤组(D 组),每组各 10 只。通过 OVA 致敏激发构建过敏性哮喘小鼠模型,分别在第 0 天、第 14 天,B 组、C 组和 D 组每只小鼠于腹腔注射 0.2 mL 抗原液(氢氧化铝2 mg,OVA 20 g),A组给予等量生理盐水
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