丙二醛氧化对牦牛肉肌浆蛋白理化特性及色泽稳定性的影响.pdf
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1、食品化学 食品科学 2023,Vol.44,No.16 113丙二醛氧化对牦牛肉肌浆蛋白理化特性及 色泽稳定性的影响陈腊梅,唐善虎*,李思宁,李锦锦,赵佳莹,李巧艳(西南民族大学食品科学与技术学院,四川 成都 610041)摘 要:利用不同浓度丙二醛(malondialdehyde,MDA)氧化牦牛肉源肌浆蛋白(sarcoplasmic proteins,SP),通过评价SP侧链氨基酸氧化情况、蛋白结构、色泽、肌红蛋白(myoglobin,Mb)氧化状态,探讨脂质氧化对牦牛肉SP理化特性及色泽稳定性的影响。结果表明:经过MDA氧化后,SP的a*值、b*值、C*值、脱氧肌红蛋白含量和氧合肌红蛋白
2、含量均显著降低(P0.05),L*值、高铁肌红蛋白含量和超铁肌红蛋白浓度均显著升高(P0.05),即MDA氧化导致色泽稳定性降低。SP的羰基含量、二聚酪氨酸含量、SP-MDA加合物荧光强度、-螺旋和-转角相对含量均显著升高(P0.05),总巯基含量、表面疏水性、内源荧光强度、-螺旋和无规卷曲相对含量均显著降低(P0.05),十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示小分子条带的模糊扩展和高分子聚集物的形成,反映MDA促进了SP的氧化、聚集。Pearson相关性分析揭示了MDA氧化、SP理化性质、色泽稳定性三者之间的强相关性(P0.05)。本研究认为,MDA通过直接氧化SP和间接介导Mb氧化改变
3、了SP结构,并导致SP交联聚集和色泽稳定性降低。关键词:丙二醛氧化;肌浆蛋白;色泽稳定性;牦牛肉Effect of Malondialdehyde Oxidation on Physicochemical Properties and Color Stability of Yak Meat Sarcoplasmic ProteinsCHEN Lamei,TANG Shanhu*,LI Sining,LI Jinjin,ZHAO Jiaying,LI Qiaoyan(College of Food Science and Technology,South West Minzu Universit
4、y,Chengdu 610041,China)Abstract:Sarcoplasmic proteins(SP)derived from yak meat were oxidized by malondialdehyde(MDA)at different concentrations.The effects of lipid oxidation on physicochemical properties and color stability of SP were investigated by evaluating side-chain amino acid oxidation,prote
5、in structure and color of SP and the oxidation status of myoglobin(Mb).The results showed that after MDA oxidation,the a*value,b*value,C*value,and deoxymyoglobin and oxymyoglobin contents of SP significantly decreased(P 0.05),and the L*value,metmyoglobin content,and ferrylmyoglobin concentration sig
6、nificantly increased(P 0.05),indicating that MDA oxidation lowered color stability.The contents of carbonyl groups and dimeric tyrosine,the fluorescence intensity of SP-MDA adducts,and the relative contents of-helix and-turn significantly increased(P 0.05),and total sulfhydryl content,surface hydrop
7、hobicity,intrinsic fluorescence intensity,and the relative contents of-helix and random coil significantly declined(P 0.05).Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)showed blurred expansion of small molecule bands and the formation of macromolecular aggregates,suggesting th
8、at MDA promoted the oxidation and aggregation of SP.Pearson correlation analysis revealed significant correlations between MDA oxidation and physicochemical properties and color stability of SP(P 0.05).This study reveals that MDA alters the structure of SP by directly oxidizing it or mediating Mb ox
9、idation,causing cross-linked aggregation of SP and reducing its color stability.Keywords:malondialdehyde oxidation;sarcoplasmic protein;color stability;yak meatDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220730-345中图分类号:TS251.5 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)16-0113-08收稿日期:2022-07-30基金项目:中央高校创新团队项目(2021XJTD02)第一作者简介:陈
10、腊梅(1998)(ORCID:0000-0002-0656-8719),女,硕士研究生,研究方向为畜产品加工与安全。E-mail:*通信作者简介:唐善虎(1964)(ORCID:0000-0002-2416-4443),男,教授,博士,研究方向为动物性食品加工与安全。E-mail:114 2023,Vol.44,No.16 食品科学 食品化学引文格式:陈腊梅,唐善虎,李思宁,等.丙二醛氧化对牦牛肉肌浆蛋白理化特性及色泽稳定性的影响J.食品科学,2023,44(16):113-120.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220730-345.http:/ CHEN Lamei
11、,TANG Shanhu,LI Sining,et al.Effect of malondialdehyde oxidation on physicochemical properties and color stability of yak meat sarcoplasmic proteinsJ.Food Science,2023,44(16):113-120.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220730-345.http:/肉色是消费者判断肉品新鲜程度的直观指标,直接影响了消费者的购买愿望1。宰后肌
12、肉的肉色主要取决于肉肌浆中血红素蛋白质 肌红蛋白(myoglobin,Mb)的状态,在加工贮藏过程中,肉及肉制品发生氧化,高铁肌红蛋白(metmyoglobin,MMb)逐渐累积,肉色劣变为令人难以接受的灰褐色2-3。肉及肉制品的氧化可被视为级联反应,即脂质氧化、蛋白质氧化、肌红蛋白氧化之间相互促进、相互作用4。普遍认为,脂质氧化是影响肉色稳定性的重要因素,脂质氧化程度越高,肉色稳定性越低1,5。王兆明等6研究脂质过氧自由基诱导兔肉肌浆蛋白(sarcoplasmic proteins,SP)聚集机制发现,过氧自由基不仅可以直接引发SP聚集,还可以通过介导Mb自氧化促进SP交联聚集,对肉的保水性
13、和色泽具有重要影响。据报道,脂质氧化的次级产物比初级产物更容易与蛋白质发生作用7。如,-不饱和醛具有高反应性和稳定性,很容易在肌浆中扩散,通过共价加成与Mb反应,改变蛋白质的三级结构并使其易于进一步氧化4,8。丙二醛(malondialdehyde,MDA)是肉类贮藏过程中脂质氧化次级产物中最丰富且具代表性的活性醛类之一,来源于多种不饱和脂肪酸,具有较强的诱导蛋白氧化变性能力,是脂质氧化应激的标志物9。Wang Zhaoming等10观察到MDA氧化不仅促进了兔肉源Mb的自氧化,还导致了超铁肌红蛋白(ferrylmyoglobin,Mb(IV)O)及其他活性物质的生成,从而影响兔肉品质。Bon
14、ny11研究表明MDA可能通过牛肉源氧合肌红蛋白(oxymyoglobin,OMb)氧化为MMb而调控肉色。也有研究表明,脂质氧化引起的肉色变化具有物种特异性,具有高含量组氨酸残基的氧合肌红蛋白的肉类更易受到脂质氧化产物的亲核攻击12。牦牛生长在高寒低氧地区,其Mb含量高,内源性抗氧化能力强13。SP占骨骼肌总蛋白的30%,是Mb的主要存在场所;同时,SP中还含包含了多种可溶性酶类、抗氧化蛋白和物质,调控影响肉色稳定性的生化过程14-15。因此,SP一直是肉色领域的重点研究对象。然而,目前鲜见MDA氧化对牦牛肉肉色稳定性影响的报道,同时,有关肉色稳定性的研究聚焦于Mb,肉色与SP理化性质关系尚
15、不清楚。因此,本研究构建MDA氧化体系,探讨不同脂质氧化程度下牦牛肉SP理化性质变化与色泽稳定性的关系,旨在为牦牛肉的加工与贮藏提供参考依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂牦牛肉购于四川成都双流区白家明宣鲜牛肉门市部。选取自然放牧状态下34 岁雄性健康麦洼牦牛(平均质量230 kg),经屠宰后室温下排酸6 h,随机选取2 条背长肌,用保温箱(内含冰袋,04)运回实验室(1 h),于20 冰箱内贮藏待用。2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,D N P H)、溴 酚 蓝、三 氯 乙 酸、乙 酸 乙 酯、冰醋 酸 成 都 科 隆 化 学 品 有 限 公 司;盐
16、 酸 胍、十 二 烷 基 硫 酸 钠(s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e,S D S)、尿 素、三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷(t r i s-(hydroxymethyl)-aminomethane,Tris)德国 BioFroxx公司;考马斯R-250、考马斯-G250上海源叶生物有限公司;5,5-二硫基-2,2-二硝基苯甲酸(5,5-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB)、1,1,3,3-四甲氧基丙烷(1,1,3,3-tetramethoxy-propan,TMP)上海麦克林生化科技有限公司;5蛋白上样缓冲
17、液(含二硫苏糖醇)北京索莱宝科技有限公司;宽范围彩色预染蛋白质Marker MP206天根生化科技有限公司。1.2仪器与设备PL303分析天平梅特勒-托利多国际股份有限 公司;全温振荡培养箱上海智城分析仪器制造有限公司;ALPHALSC冷冻干燥机德国Martin Christ 公司;Centrifuge 5804R高速冷冻离心机德国Eppendorf公司;UV1810S紫外分光光度计上海佑科仪器仪表有限公司;F-4700型荧光分光光度计日本那珂事务所;CR-700d/600d色差仪日本Konica Minolta公司;傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared,F
18、TIR)仪美国PeakinElmer公司。1.3 方法1.3.1 SP的提取参考Xue Chaoyi等16的方法并略作修改。取冷藏解冻后的牦牛肉背最长肌,剔除筋膜、脂肪后,将牦牛肉切成均匀的小块,放入绞肉机中绞碎制成直径5 mm的肉糜。取200 g牦牛肉糜按料液比1 4(g/mL)加入40 mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.0),10 000g匀浆1 min,浸提30 min后离心(4、4 500g、15 min),滤纸过滤,所得滤液即为SP溶液。采用双缩脲法进行测定蛋白质量浓度,并调整质量浓度为10 mg/mL。食品化学 食品科学 2023,Vol.44,No.16 1151.3.2 M
19、DA氧化体系构建参考Wang Zhaoming等10的方法并略作修改。取4.2 mL TMP溶于5 mL 5 mol/L HCl溶液,纯水定容至25 mL中,40 避光水浴加热30 min,直至溶液颜色变为深黄色,冷却至室温后用6 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0,4 避光贮藏备用。将MDA稀释104 倍,在267 nm波长处测定浓度,摩尔吸光系数为 31 500 L/(molcm)。往SP溶液中加入不同体积的MDA,再加入0.02%的叠氮化钠,防止微生物生长,使MDA最终浓度分别为0、0.1、1、2、5、10 mmol/L。在4 避光振荡反应12 h,随后置于4 去离子水中透析48
20、 h。透析袋截留分子质量7 kDa,每2 h换1 次去离子水(1.0 L/次)。最后冷冻干燥得到不同氧化程度的SP。1.3.3 SP色泽的测定色差仪采用D65光源,8 mm孔径,近似角度10,经零校正、白板校正后使用。用40 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)将SP溶解,质量浓度调至10.0 mg/mL。取适量SP溶液于直径5 cm的透明小杯中,置于白色载物板上,以载物板和透明小杯为标准去除背景影响,每个样品平行测定6 次,记录样品的亮度值(L*值)、红度值(a*值)、黄度值(b*值),并计算色饱和度(C*值)和色调角(H*值)17。C*?a*2?b*2(1)H*?tan?1a*b*(2
21、)1.3.4 Mb氧化状态的测定参考Krzywicki18的方法并略作修改。将SP溶液稀释至5.0 mg/mL,离心(4、2 500 g、20 min),过滤上清液,取滤液分别在525、545、565、572 nm波长处测定吸光度。根据式(3)(5)计算脱氧肌红蛋白(deoxymyoglobin,DMb)、OMb、MMb的相对含量。DMb/%?0.369R1?1.140R2?0.941R3?0.015?100(3)OMb/%?0.882R1?1.267R2?0.809R3?0.361?100(4)MMb/%?2.514R1?0.777R2?0.800R3?1.098?100(5)式中:R1A5
22、72/A525,R2A565/A525,R3A545/A525。参考Wang Zhaoming等10的方法并略作修改。在410 nm波长处测定5.0 mg/mL SP溶液吸光度,根据 式(6)计算Mb(IV)O浓度。Mb?IV?O?/?mol/L?1?bA412 nm?103(6)式中:1111 L/(mmolcm);b为比色皿光径,1 cm。1.3.5 SP羰基含量的测定参考李思宁等19的方法并略作修改。取1 mL 5.0 mg/mL SP溶液加入1 mL含0.02 mol/L DNPH的2 mol/L HCl溶液,以2 mol/L HCl溶液为对照,室温下避光反应40 min,每隔15 m
23、in振荡混匀1 次。加入预冷的1 mL 20%三氯乙酸溶液并离心(4、10 000g、5 min),除去上清液,加入1 mL 乙醇-乙酸乙酯(1 1,V/V)溶液,离心洗涤沉淀3次(4、10 000g、5 min)。加入3 mL 6 mol/L盐酸胍溶液,37 保温15 min溶解沉淀,离心(4、10 000 g、3 min)除去不溶物质,在波长370 nm处测定吸光度。以每毫克蛋白含羰基量表示(nmol/mg)。羰基含量计算公式如下:2?b?c106?A370 nm?n?/?nmol/mg?(7)式中:A370 nm为样品吸光度;n为稀释倍数(3);222 000 L/(molcm);c为S
24、P质量浓度/(mg/mL)。1.3.6 SP总巯基含量的测定参考邓小蓉等20的方法并略作修改。取1 mL 5 mg/mL SP溶液,分别加入8 mL Tris-甘氨酸(含10.4 g/L Tris,6.9 g/L甘氨酸,1.2 g/L EDTA-2Na,8 mol/L尿素,pH8.0),混合后离心(4、8 000 r/min、15 min)去除不溶性蛋白,再向溶液中加入0.5 mL 10 mmol/L DTNB混合,室温下反应30 min,412 nm波长处测定吸光度。总巯基含量计算公式如下:3?b?c106?A412 nm?n?/?nmol/mg?(8)式 中:A4 1 2 n m为 样 品
25、 吸 光 度;n 为 1 0;313 600 L/(molcm)。1.3.7 SP二聚酪氨酸含量的测定参考Davies等21的方法。将SP溶液质量浓度调至0.1 mg/mL,设定发射波长420 nm,激发波长325 nm,狭缝宽度均为10 nm,电压400 V。扫描至少6 次并记录,二聚酪氨酸含量以相对荧光强度表示。1.3.8 SP-MDA加合物荧光强度的测定参考Wang Zhaoming等10的方法。将SP溶液质量浓度调至0.5 mg/mL,激发波长390 nm,狭缝宽度均为5 nm,扫描速率1 200 nm/min,电压400 V,记录SP在400500 nm波长处的荧光扫描光谱。1.3.
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