一叶萩碱对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能的影响.pdf
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1、天津医药 2023 年 9 月第 51 卷第 9 期一叶萩碱对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能的影响张金武,谢丁玲,陈莉摘要:目的基于Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-B(NF-B)通路,探讨一叶萩碱(SE)对大鼠脑缺血再灌注损伤(CIRI)后神经功能的影响及相关机制。方法100只成年SD大鼠随机分为假手术组(Sham组),模型组(CIRI组),SE低、中、高剂量组,每组20只。采用线栓法建立大鼠CIRI模型,建模成功后立即腹腔注射低、中、高剂量(20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg)的SE,连续3 d,Sham组与CIRI组给予等量生理盐水。术后24、48、72 h,参
2、照Longa法对各组大鼠进行神经功能缺损评分;术后72 h,干湿重法测定大鼠脑组织含水量,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色评估大鼠脑梗死体积百分比,Western blot检测大鼠脑组织离子钙结合衔接分子1(Iba-1)、TLR4、NF-B p65和p-NF-B p65蛋白表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠脑组织白细胞介素(IL)-1、肿瘤坏死因子-(TNF-)和IL-6水平,免疫荧光染色检测小胶质细胞活化和神经元存活情况。结果与Sham组相比,CIRI组大鼠神经功能缺损评分、脑组织含水量升高,脑梗死体积百分比增大,脑组织中TLR4、p-NF-B p65、Iba-1、IL-
3、1、TNF-和IL-6表达水平升高(P0.05)。中、高剂量的SE可降低大鼠CIRI后神经功能缺损评分和损伤后脑组织含水量,降低脑梗死体积百分比及损伤区域TLR4、p-NF-B p65、Iba-1蛋白表达水平及IL-1、TNF-和IL-6水平(P0.05)。结论SE可通过抑制TLR4/NF-B通路激活降低大鼠CIRI后神经炎症反应,发挥脑保护作用。关键词:脑缺血;再灌注损伤;TLR4/NF-B通路;一叶萩碱;炎性因子中图分类号:R743.3文献标志码:ADOI:10.11958/20221801The effect of securinine on neurological function
4、recovery after cerebral ischemia-reperfusioninjury in ratsZHANG Jinwu,XIE Dingling,CHEN LiDepartment of Neurology,Xianning Central Hospital,the First Affiliated Hospital of Hubei University of Science andTechnology,Xianning 437100,ChinaCorresponding AuthorE-mail:Abstract:ObjectiveTo explore the effe
5、ct and mechanism of securinine(SE)on cerebral ischemia reperfusion injury(CIRI)in rats based on toll-like receptor 4(TLR4)/nuclear transcription factor-kappa B(NF-B)pathway.MethodsAtotal of 100 male or female adult SD rats were randomly divided into the sham group,the CIRI group and the SE low-,medi
6、um-and high-dose(20 mg/kg,40 mg/kg,80 mg/kg)groups,with 20 rats in each group.The rat model of CIRI wasestablished by thread occlusion.Rats were treated with SE(20 mg/kg,40 mg/kg and 80 mg/kg)immediately after successfulmodeling for 3 consecutive days.Rats in the sham group and the CIRI group were g
7、iven the same amount of normal saline.At24 h,48 h and 72 h after operation,the neurological deficits of rats were measured according to Longa score.At 72 h afteroperation,brain tissue water content was evaluated by wet-dry weight method,and the percentage of cerebral infarctionvolume was assessed by
8、 triphenyltetrazolium chloride(TTC)staining.Protein expression levels of Iba-1,TLR4,NF-B p65and p-NF-B p65 in brain tissue were determined by Western blot assay.Expression levels of inflammatory factors such asinterleukin-1(IL-1),tumor necrosis factor-(TNF-)and IL-6 were detected by enzyme-linked im
9、munosorbent assay(ELISA).Level of microglia activation and the number of surviving neurons were examined by immunofluorescence staining.ResultsCompared with the sham group,neurological function scores,brain tissue water content and the percentage ofcerebral infarction volume were significantly incre
10、ased in the CIRI group(all P0.05).Expression levels of TLR4,p-NF-B p65,Iba-1,IL-1,TNF-and IL-6 in brain tissue were significantly increased(all P0.05).However,medium-andhigh-doses of SE could significantly alleviate the neurological deficits,reduce the water content of brain tissue and the sizeof ce
11、rebral infarction volume,decrease expression levels of TLR4,p-NF-B p65,Iba-1,IL-1,TNF-and IL-6 in theinjured area of brain tissue in rats.ConclusionSE can alleviate CIRI-induced neuroinflammatory response via inhibitingTLR4/NF-B pathway activation,thereby conferring a protective role in brain of rat
12、s.Key words:brain ischemia;reperfusion injury;TLR4/NF-B pathway;securinine;inflammatory factors作者单位:咸宁市中心医院/湖北科技学院附属第一医院神经内科(邮编437100)作者简介:张金武(1980),男,副主任医师,主要从事神经系统变性病及脑血管病方面研究。E-mail:通信作者E-mail:实验研究977Tianjin Med J,September 2023,Vol.51 No.9缺血性脑卒中是一种严重的急性脑血管疾病,具有高发病率、高致残率和高死亡率等特点1。早期恢复局部脑血流量是治疗脑卒中
13、的关键,然而脑血管再通后可能进一步诱发脑组织损伤和加重神经功能缺损,即脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemiareperfusion injury,CIRI)2。CIRI的损伤机制错综复杂,主要涉及离子失衡、血脑屏障(BBB)损伤、能量代谢障碍、兴奋性氨基酸细胞毒性、炎症反应和氧化应激等多个病理过程,其中炎症反应是CIRI发生发展的重要病理机制3。大量研究显示,减轻大鼠炎症反应可以改善CIRI后的神经功能4-5。因此,抑制CIRI后炎症反应的激活,减少促炎因子的释放,对改善脑损伤具有显著的意义。一叶萩碱(securinine,SE)又名一叶碱,是一种从植物根部提取的生物碱6,已经证
14、实 SE 可以特异性拮抗-氨基丁酸(GABA)A受体的活性,因此被广泛应用于中枢神经系统疾病的治疗,如肌萎缩侧索硬化症7、小儿麻痹症8和多发性硬化症9。近年来,体内外相关研究发现,SE在帕金森病(Parkinsons disease,PD)中发挥着显著的抗炎和神经保护作用10-11。然而有关SE在CIRI中应用的研究尚鲜见报道。基于此,本研究旨在探讨SE对大鼠CIRI后神经功能的影响及其可能的作用机制。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物2月龄清洁级成年SD大鼠100只,雌雄各半,体质量(20020)g,购自辽宁长生生物技术股份有限公司,动物生产许可证号:SCXK(辽)2020-0001。
15、所有动物饲养于温度(222),湿度50%20%,自由饮水和摄食,12 h昼夜规律交替的动物房中。本研究所有动物实验均遵循“国家实验动物护理和使用健康研究所指南”(NIH出版物No.80-23)进行,并获得湖北科技学院动物伦理委员会批准(编号:2020-01-900)。1.1.2主要试剂与仪器线栓(北京西浓科技有限公司),SE(纯度98,中国源叶生物科技有限公司),离子钙结合衔接分子1(Iba-1)、Toll样受体4(TLR4,美国Santa Cruz公司),核转录因子-B(NF-B)p65/p-p65、-actin、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔/鼠IgG H&L(沈阳万类生物科技有限公
16、司),Neuron(美国 Millipore 公司),荧光二抗兔/鼠(美国ThermoFisfer Scientific公司),大鼠白细胞介素(IL)-1、肿瘤坏死因子-(TNF-)和IL-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司),PVDF膜(0.45 m,美国Millipore公司),RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、Westernblot制胶试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司),标准蛋白Maker(上海雅酶生物医药科技有限公司),超敏ECL发光试剂盒(沈阳万类生物科技有限公司)。2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,美国Sigma公司),超敏ECL化学发光试剂
17、盒(北京 biosharp 公司),蛋白电泳仪、转膜装置(美国 Bio-Rad公司)。1.2方法1.2.1动物模型构建100只大鼠适应性饲养1周后,采用随机数字表法分为假手术组(Sham组),模型组(CIRI组),SE低、中、高剂量组,每组20只。参照改良的Zea-Longa12线栓法建立大鼠CIRI模型。过程如下:腹腔注射2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉,满意后,颈部剃毛,皮肤碘伏消毒,沿正中偏右切口分离暴露右颈总、颈内和颈外动脉,结扎右颈总和颈外动脉近心端,颈总动脉头侧端剪口,将线栓从颈内动脉轻柔推至大鼠大脑前动脉,进线长度约20 mm,固定后缝合。线栓阻断2 h后抽出丝线,切口丝线
18、结扎。Sham组仅分离血管,不进行剪口和线栓操作。SE低、中、高剂量组于造模成功后立即腹腔分别注射20、40、80 mg/kg SE,持续3 d。造模成功标志为麻醉清醒后,大鼠提尾时左侧前肢不能前伸,爬行时向患侧偏斜,不能走直线。造模不成功或未到相应时间死亡者被剔除,并按照随机原则及时补充。Sham组与CIRI组腹腔注射等体积的生理盐水。1.2.2神经功能缺损评分术后24、48、72 h,每组随机抽取8只大鼠,由单盲观察者参照Longa评分法进行神经功能缺损评分:0分,无神经功能缺损;1分,轻度神经功能缺损,梗死半球对侧前爪不能完全伸展;2分,中度神经功能缺损,行走时向梗死半球侧转圈;3分,严
19、重神经功能缺损,行走时向梗死半球侧倾倒;4 分,无法自发行走,刺激无反应,存在意识丧失。1.2.3TTC染色检测大鼠脑梗死体积百分比术后72 h,每组随机抽取5只大鼠,成功麻醉后,立即断头处死并迅速取出大脑组织,于脑切片机上连续切取5个冠状脑片(厚2 mm),随后置于2%的TTC染色液中,37 避光孵育1520 min,随即浸于4%多聚甲醛溶液4 固定24 h。将切片平铺于纯色版上扫描,经TTC染色后,正常脑组织显示红色,梗死区域出现白色,梗死体积百分比=(梗死总体积/脑部总体积)100%,采用Image J软件进行数据分析。1.2.4脑含水量的检测采用干湿重法13检测各组大鼠脑含水量变化,用
20、于评估脑水肿的程度。术后72 h,每组随机抽取6只大鼠,成功麻醉后,断头处死,快速分离取出脑组织,放入电子天平称湿质量,随后将脑组织放置105 烘箱中烘烤24 h直至完全烘干,称干质量3次,取其平均值。最后统计各组脑含水量=(湿质量-干质量)/湿质量100%。1.2.5Western blot 检测大鼠脑组织 Iba-1、TLR4 和 NF-Bp65蛋白表达术后72 h,每组随机抽取6只大鼠,成功麻醉后,断头处死。冰上快速取出大脑梗死组织,其中一半组织采用RIPA裂解并提取组织总蛋白,经过BCA法测定蛋白浓度后制备样品。取25 g蛋白样品上样,行10%SDS-PAGE,湿转法转膜,室温下封闭液
21、快速封闭12 min后加入一抗Iba-1、TLR4(均1 200)和NF-B p65、p-NF-B p65、-actin(均1 1 000),4 摇床孵育过夜,次日回收相应一抗,于0.1 mol/LTBST清洗(5 min3次)后加入鼠二抗或兔二抗(15 000)室温摇床孵育 2 h,再次 0.1 mol/L TBST 洗涤(5 min3次)后ECL显色,以-actin为内参,通过计算各组蛋白与相应内参的灰度值比值,检测目的蛋白的相对表达水平。1.2.6ELISA法检测大鼠脑组织IL-1、TNF-和IL-6分子表达快速收取1.2.5中另一半大鼠脑组织,充分研磨后收取978天津医药 2023 年
22、 9 月第 51 卷第 9 期上清液,按照相关 ELISA 试剂盒说明书步骤检测 IL-1、TNF-和IL-6的表达水平。1.2.7免疫荧光染色检测大鼠脑组织Iba-1和Neuron蛋白表达术后72 h,每组取3只大鼠,成功麻醉后,立即暴露胸腔,于左心室插管注入提前预冷的生理盐水,剪刀剪破右心耳,待流出清澈液体后,换用4%多聚甲醛灌流直至大鼠颈部强直,肝肠发白,四肢、尾部僵硬后取出右侧损伤脑组织。随后依次将其浸泡于4%多聚甲醛固定及30%蔗糖溶液沉糖。OCT包埋后速冻,连续获取厚度8 m冰冻切片,室温放置30 min后,0.1 mol/L PBS清洗(5 min3次),10%山羊血清室温封闭1
23、 h后加入Iba-1(1 50)或Neuron(1 50),4 冰箱孵育过夜。次日,0.1 mol/L PBS清洗(5 min3次)后滴加1 400的鼠荧光二抗,室温避光孵育 2 h。0.1 mol/L PBS 清洗(5 min3次),DAPI染色8 min并用50%甘油封片,随后荧光显微镜下拍照。1.3统计学方法采用SPSS 25.0进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数标准差(xs)表示。2组均数比较采用独立样本t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析,组间多重比较行LSD-t法。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1SE促进大鼠CIRI后神经功能恢复CIRI组术后24、48和72
24、 h时大鼠神经功能缺损评分均高于Sham组(P0.05),SE低剂量组与CIRI组比较差异无统计学意义(P0.05)。除术后24 h时SE中剂量组与CIRI组差异无统计学意义外,SE中、高剂量组大鼠神经功能缺损评分均低于CIRI组(P0.05)。术后24、48 h时,SE低、中、高剂量组大鼠神经功能缺损评分差异无统计学意义;术后72 h时,SE低、中、高剂量组大鼠神经功能缺损评分依次降低(P0.05)。见表1。2.2SE降低大鼠CIRI后脑梗死体积百分比及缓解脑水肿Sham组大鼠脑组织颜色正常,未见梗死。与Sham组比较,CIRI组大鼠脑梗死体积百分比增大,脑组织含水量增多(P0.05)。与C
25、IRI组比较,SE低剂量组大鼠脑梗死体积百分比及脑组织含水量差异均无统计学意义;中、高剂量组大鼠脑梗死体积百分比减小,脑组织含水量降低(P0.05)。SE低、中、高剂量组脑梗死体积百分比依次降低(P0.05)。见图1、表2。2.3SE 抑制大鼠 CIRI 后 TLR4、p-NF-B p65 和Iba-1蛋白的表达与Sham组相比,CIRI组大鼠脑组织TLR4、p-NF-B p65和Iba-1蛋白表达水平均升高(P0.05),SE低剂量组与CIRI组差异无统计学意义。SE中、高剂量组大鼠脑组织TLR4、p-NF-B p65和Iba-1蛋白表达水平均低于CIRI组和SEFig.1Percentag
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