LncRNA-MIAT通过抑制miR-519d-3p激活EZH2促进甲状腺癌的恶性行为.pdf
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1、论 著【文章编号】1006-6233(2023)08-1233-08LncRNA-MIAT 通过抑制 miR-519d-3p 激活 EZH2促进甲状腺癌的恶性行为吾甫尔依马尔,王护国(新疆医科大学第一附属医院血管甲状腺外科,新疆乌鲁木齐 830054)【摘要】目的:探讨长链非编码 RNA MIAT(LncRNA-MIAT)对甲状腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的调控作用与分子机制。方法:用癌症基因组图谱(TCGA)和甲状腺癌(THCA)mRNA-seq 数据分析 LncRNA-MIAT 和组蛋白甲基化转移酶 2(EZH2)在甲状腺癌中的表达。用人正常甲状腺细胞系 Nt-hy-ori 3-1 和人
2、甲状腺癌细胞系 FTC-133 作为靶细胞。qPCR 法检测 LncRNA-MIAT、miR-519d-3p、EZH2 mRNA 的表达水平差异。RNA 荧光原位杂交(FISH)检测 LncRNA-MIAT 在 FTC-133 细胞中的定位,Western blot 检测 EZH2 蛋白的表达。荧光素酶报告基因检测 LncRNA-MIAT 和 miR-519d-3p 以及 miR-519d-3p 与 EZH2 的直接作用。将 FTC-133 细胞分为 6 组空白对照组(control 组)、空载体组(Empty vector 组)、过表达 LncRNA-MIAT 组(LncRNA-MIAT 组
3、)、miR-519d-3p 的抑制剂组(miR-519d-3p inhibitor 组)、EZH2 的抑制剂 EPZ-6438 处理组(EPZ-6438 组)、miR-519d-3p 抑制剂联合过表达 LncRNA-MIAT 组(LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor 组)。用 Edu 试剂盒和平板克隆法检测细胞增殖。用流式细胞术检测细胞凋亡。用 Transwell 细胞迁移和侵袭实验检测细胞的行为。结果:LncRNA-MIAT 和 EZH2 在甲状腺癌组织和细胞中的表达均上调,二者具有正相关性(r=0.466,P0.05),miR-519d-3p 在 FTC-13
4、3 细胞中表达下调(P0.05)。经过双荧光素酶报告基因实验检测发现miR-519d-3p 的靶基因是 EZH2,且 LncRNA-MIAT 靶向抑制 miR-519d-3p 激活 EZH2。与 Empty vec-tor 组相比,LncRNA-MIAT 组和 miR-519d-3p inhibitor 组的 Edu 阳性细胞百分比、细胞克隆数、细胞侵袭和迁移数均显著上调(P0.05),细胞凋亡率均减少(P0.05)。EZH2 的抑制剂 EPZ-6438 则减少Edu 阳性细胞百分比、细胞克隆数、细胞侵袭和迁移数(P0.05),增加细胞凋亡率(P0.05)。分别与LncRNA-MIAT 组或
5、miR-519d-3p inhibitor 组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor 组的 Edu 阳性细胞百分比、细胞克隆数、细胞侵袭和迁移数均显著上调(P0.05),细胞凋亡率降低(P0.05)。结论:甲状腺癌细胞中 LncRNA-MIAT 通过抑制 miR-519d-3p 激活 EZH2 促进甲状腺癌的恶性行为。【关键词】甲状腺癌;长链非编码 RNA MIAT;miR-519d-3p;组蛋白甲基化转移酶 2;细胞恶性行为【文献标识码】A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2023.08.01LncRNA-MIAT Promotes
6、 Malignant Behavior of Thyroid Cancer by Inhibiting miR-519d-3p to Activate EZH2WUPUER Yimaer,WANG Huguo(The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Xinjiang Urumqi 830054,China)【Abstract】Objective:To investigate the regulation and molecular mechanism of long non-coding RNA MIAT(Lnc
7、RNA-MIAT)on proliferation,apoptosis,migration and invasion of thyroid cancer cells.Meth-ods:The expression of LncRNA-MIAT and histone methyltransferase 2(EZH2)in thyroid cancer was ana-lyzed by Cancer Genome Atlas(TCGA)and thyroid cancer(THCA)mRNA-seq data.Human normal thyroid 3321 第 29 卷 第 8 期2023
8、年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 【基金项目】新疆维吾尔自治区自然科学基金,(编号:2021D01C325)【通讯作者】王护国cell line Nthy-ori 3-1 and human thyroid cancer cell line FTC-133 were used as target cells.The mRNA ex-pression levels of LncRNA-MIAT,miR-519d-3p and EZH2 were detected by qPCR.RNA fluorescence in situ hy
9、bridization(FISH)was used to detect the localization of LncRNA-MIAT in FTC-133 cells,and West-ern blot was used to detect the expression of EZH2 protein.Luciferase reporter gene was used to detect Ln-cRNA-MIAT and miR-519d-3p and the direct effect of miR-519d-3p on EZH2.FTC-133 cells were divid-ed i
10、nto 6 groups(control group,Empty vector group,LncRNA-MIAT group(LncRNA-MIAT group),miR-519d-3p inhibitor group(miR-519d-3p group),EZH2 inhibitor EPZ-6438 treatment group(EPZ-6438 group),miR-519d-3p inhibitor combined with overexpression of LncRNA-MIAT group(LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor group).C
11、ell proliferation was detected by Edu kit and plate cloning.Apoptosis was detected by flow cytometry.Cell behavior was detected by Transwell cell migration and invasion assay.Re-sults:The expressions of LncRNA-MIAT and EZH2 in thyroid carcinorna tissues and cells were up-regula-ted,and there was a p
12、ositive correlation between the two(r=0.466,P0.05).The expression of miR-519d-3p was down-regulated in FTC-133 cells(P0.05).Double luciferase reporter assay showed that the tar-get gene of miR-519d-3p was EZH2,and LncRNA-MIAT targeted inhibition of miR-519d-3p to activate EZH2.Compared with Empty ve
13、ctor group,the percentage of Edu positive cells,the number of cell clones,the number of cell invasion and migration in LncRNA-MIAT group and miR-519d-3p inhibitor group were significantly up-regulated(P0.05),and the cell apoptosis rate was decreased(P0.05).EZH2 inhibitor EPZ-6438 decreased the perce
14、ntage of Edu positive cells,the number of cell clones,the number of cell inva-sion and migration(P0.05),and increased the rate of apoptosis(P0.05).Compared with LncRNA-MI-AT group or miR-519d-3p inhibitor group,the Edu positive cell percentage,cell clone number,cell invasion and migration number of
15、LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor group were significantly up-regulated(P0.05),respectively.The apoptosis rate was decreased(P0.05).Conclusion:LncRNA-MIAT can pro-mote the malignant behavior of thyroid cancer by inhibiting the activation of EZH2 by miR-519d-3p.【Key words】Thyroid carcinoma;LncRNA-MIA
16、T;miR-519d-3p;Histone methylated transfer-ase 2;Cell malignant behavior 甲状腺癌(thyroid cancer,THCA)是最常见的内分泌恶性肿瘤之一,近30 年来其发病率持续上升1。尽管大多数甲状腺癌患者表现出良好的生存,但据报道,初次手术治疗后的复发率为 8%至 23%,这极大地影响了患者的生活质量2。近年来,研究表明,由于基因组不稳定或表观遗传标记改变导致的基因异常表达在甲状腺癌的调控中起着重要作用3。在众多理论中,竞争内源性 RNA(competing endogenous RNA,ceR-NA)假说尤其受到人们的
17、关注,这一假说描述一个由微小 RNA(microRNA,miRNA)介导的复杂的转录后调控网络:通过共享一个或多个 miRNA 响应元件,长链非编码 RNA(LncRNA)竞争性地与 miRNA 的结合,从而在功能上释放了受 miRNA 调控的靶 mRNA4。然而,目前甲状腺癌中的 ceRNA 机制还不十分清楚,需要进一步的研究。心肌梗死相关转录物 LncRNA(Ln-cRNA-MIAT)是一种关键的促癌基因,已被研究证实在多种癌症中表达增高,而且可以参与调控肝癌和胃癌等恶性肿瘤的进展5。然而,LncRNA-MIAT 在甲状腺癌中的作用与机制仍不十分清楚。本研究通过TCGA 数据库(https
18、:/www.cancer.gov/about-nci/or-ganization/ccg/research/structural-genomics/tcga)、Starbase(https:/ LncRNA-MIAT 相关的 ceRNA 网络中涉及 28 个 miRNA 和 203 个 mRNA,其中在 TCGA 数据中 miR-519d-3p 在甲状腺癌中极低表达,而且 MI-AT 和其中的 EZH2 在包括甲状腺癌在内的多种类型癌症中呈极显著正相关关系。因此我们假设 LncRNA-MIAT 可能在甲状腺癌中扮演促癌作用,且存在 Ln-cRNA-MIAT-miR-519d-3p-EZH2 这
19、条调控网络,并且本文通过体外实验研究了 LncRNA-MIAT 对甲状腺癌细胞恶性行为的调控作用并初步探讨了机制。1 材料与方法1.1 细胞与主要试剂:人正常甲状腺细胞系 Nthy-ori 3-1 和人甲状腺癌细胞系 FTC-133 均购自中国科学院典型培养物保藏中心。胎牛血清(FBS)、DMEM 培4321 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 养基均购自美国 Gibco 公司。兔抗 EZH2 抗体、GAP-DH 抗体、辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗兔 IgG二抗均购自英国 Abcam 公司。
20、用于阻断 EZH2 活性的EPZ-6438 购于美国 MCE 公司。免疫荧光原位杂交试剂盒购于上海碧云天公司。Cy3 标记的抗小鼠二抗和 Cy3 标记的抗兔二抗均购于美国 Abcam 公司。1.2 方 法1.2.1 细胞培养和分组:细胞培养 FTC-133 细胞和 Nthy-ori 3-1 细胞用含有 10%FBS 的 DMEM 培养基,置于 37、5%CO2细胞培养箱中培养。FTC-133 细胞的转染和分组:分别将 LncRNA-MIAT 过表达载体(pcDNA3.1-LncRNA-MIAT,LncRNA-MIAT)、空载体(Empty vector)(均由上海吉玛公司进行构建)转染至 FT
21、C-133 细胞,分别命名为 LncRNA-MIAT组、Empty vector 组。将 miR-519d-3p inhibitor(购于上海吉玛公司)转染至 FTC-133 细胞,命名为 miR-519d-3p inhibitor 组。用 APTO-263 处理 FTC-133 细胞,命名为 APTO-263 组。另外,将 LncRNA-MIAT 过表达载体和 miR-519d-3p inhibitor 联合转染 FTC-133 细胞,命名为 LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhib-itor 组。每组均孵育 24h。进行后续检测。1.2.2 实时定量 PCR:收集细胞的总
22、 RNA,逆转录为cDNA,行 PCR 扩增。以 GAPDH 为内参,采用 2-CT法计算 LncRNA-MIAT、miR-519d-3p、EZH2 mRNA的相对表达量。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,序列见表 1。表 1 PCR 引物序列基因序列LncRNA-MIAT5-CGTCCGACCGGATTCACA-35-TCCATCCCCACTGGGCACT-3EZH25-ATTCCGATGTGTAGGATG-35-TGTCTAACTCAAGCTGCTTCG-3miR-519d-3p5-CTGATCCGGGACGTGGACCT-35-TAGGGCCAGAGGGCGGATTA-3GAP
23、DH5-TTCCGACAGGATGCAGA-35-GCCGATCCACACGGAGTACT-3U65-TCACTCCACGGTCGTACTT-35-GCAGATCCTCACCGATTACGG-31.2.3FISH 实验:CY3 标记的 LncRNA-MIAT 探针由广州瑞博生物有限公司设计合成。4%多聚甲醛固定 FTC-133 细胞,与含有 LncRNA-MIAT 探针的杂交缓冲液在 37 暗处杂交过夜。用 DAPI(北京 Solari-bo)染细胞核。在荧光显微镜下观察切片。1.2.4 Western blot:提取各组细胞的总蛋白质。通过BCA 蛋白检测试剂盒检测总蛋白浓度。然后实施 SD
24、S-PAGE 分离蛋白质:70V 30min 转 120V 90min。然后将蛋白条带以 300mA 转移到 PVDF 膜上。在室温下用 5%脱脂牛奶封闭 2h 后,将膜与一抗在 4 下孵育过夜:anti-EZH2(1 1000),anti-GAPDH 抗体(1 2500)。然后,将膜与 HRP 偶联的山羊抗兔 IgG(1 2000)孵育 1h。用 ECL 检测试剂显示蛋白条带,并用ImageJ 软件分析每个条带的灰度值。1.2.5双荧光素酶报告基因实验:合成含 LncRNA-MIAT 野生型(MIAT-wt)或突变型(MIAT-mut)结合位点的 DNA 片段,克隆到 pMIR-GLO 荧光
25、素酶载体。分离重组质粒并测序。将 miR-519d-3p mimics 和mimics NC 分别按照说明书使用 Lipofectamine3000与 MIAT-wt/MIAT-mut 片段共转染 FTC-133 细胞。转染 4h 后,更换培养基,将细胞置于 37、5%CO2培养箱中培养 48h。用双荧光素酶试剂盒检测各组的荧光素酶活性。另外,将合成的 EZH2 3 UTR 野生型(EZH2-wt)或突变型(EZH2-mut)与 miR-519d-3p mimics 和 mimics NC 分别共转染 FTC-133 细胞,以检测 miR-519d-3p 都与 EZH2 的调控作用,其余实验方
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