LncRNA-MIAT通过抑制miR-519d-3p激活EZH2促进甲状腺癌的恶性行为.pdf

论 著【文章编号】1006-6233(2023)08-1233-08LncRNA-MIAT 通过抑制 miR-519d-3p 激活 EZH2促进甲状腺癌的恶性行为吾甫尔依马尔,王护国(新疆医科大学第一附属医院血管甲状腺外科,新疆乌鲁木齐 830054)【摘要】目的:探讨长链非编码 RNA MIAT(LncRNA-MIAT)对甲状腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的调控作用与分子机制。方法:用癌症基因组图谱(TCGA)和甲状腺癌(THCA)mRNA-seq 数据分析 LncRNA-MIAT 和组蛋白甲基化转移酶 2(EZH2)在甲状腺癌中的表达。用人正常甲状腺细胞系 Nt-hy-ori 3-1 和人甲状腺癌细胞系 FTC-133 作为靶细胞。qPCR 法检测 LncRNA-MIAT、miR-519d-3p、EZH2 mRNA 的表达水平差异。RNA 荧光原位杂交(FISH)检测 LncRNA-MIAT 在 FTC-133 细胞中的定位,Western blot 检测 EZH2 蛋白的表达。荧光素酶报告基因检测 LncRNA-MIAT 和 miR-519d-3p 以及 miR-519d-3p 与 EZH2 的直接作用。将 FTC-133 细胞分为 6 组空白对照组(control 组)、空载体组(Empty vector 组)、过表达 LncRNA-MIAT 组(LncRNA-MIAT 组)、miR-519d-3p 的抑制剂组(miR-519d-3p inhibitor 组)、EZH2 的抑制剂 EPZ-6438 处理组(EPZ-6438 组)、miR-519d-3p 抑制剂联合过表达 LncRNA-MIAT 组(LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor 组)。用 Edu 试剂盒和平板克隆法检测细胞增殖。用流式细胞术检测细胞凋亡。用 Transwell 细胞迁移和侵袭实验检测细胞的行为。结果:LncRNA-MIAT 和 EZH2 在甲状腺癌组织和细胞中的表达均上调,二者具有正相关性(r=0.466,P0.05),miR-519d-3p 在 FTC-133 细胞中表达下调(P0.05)。经过双荧光素酶报告基因实验检测发现miR-519d-3p 的靶基因是 EZH2,且 LncRNA-MIAT 靶向抑制 miR-519d-3p 激活 EZH2。与 Empty vec-tor 组相比,LncRNA-MIAT 组和 miR-519d-3p inhibitor 组的 Edu 阳性细胞百分比、细胞克隆数、细胞侵袭和迁移数均显著上调(P0.05),细胞凋亡率均减少(P0.05)。EZH2 的抑制剂 EPZ-6438 则减少Edu 阳性细胞百分比、细胞克隆数、细胞侵袭和迁移数(P0.05),增加细胞凋亡率(P0.05)。分别与LncRNA-MIAT 组或 miR-519d-3p inhibitor 组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor 组的 Edu 阳性细胞百分比、细胞克隆数、细胞侵袭和迁移数均显著上调(P0.05),细胞凋亡率降低(P0.05)。结论:甲状腺癌细胞中 LncRNA-MIAT 通过抑制 miR-519d-3p 激活 EZH2 促进甲状腺癌的恶性行为。【关键词】甲状腺癌;长链非编码 RNA MIAT;miR-519d-3p;组蛋白甲基化转移酶 2;细胞恶性行为【文献标识码】A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2023.08.01LncRNA-MIAT Promotes Malignant Behavior of Thyroid Cancer by Inhibiting miR-519d-3p to Activate EZH2WUPUER Yimaer,WANG Huguo(The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Xinjiang Urumqi 830054,China)【Abstract】Objective:To investigate the regulation and molecular mechanism of long non-coding RNA MIAT(LncRNA-MIAT)on proliferation,apoptosis,migration and invasion of thyroid cancer cells.Meth-ods:The expression of LncRNA-MIAT and histone methyltransferase 2(EZH2)in thyroid cancer was ana-lyzed by Cancer Genome Atlas(TCGA)and thyroid cancer(THCA)mRNA-seq data.Human normal thyroid 3321 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 【基金项目】新疆维吾尔自治区自然科学基金,(编号:2021D01C325)【通讯作者】王护国cell line Nthy-ori 3-1 and human thyroid cancer cell line FTC-133 were used as target cells.The mRNA ex-pression levels of LncRNA-MIAT,miR-519d-3p and EZH2 were detected by qPCR.RNA fluorescence in situ hybridization(FISH)was used to detect the localization of LncRNA-MIAT in FTC-133 cells,and West-ern blot was used to detect the expression of EZH2 protein.Luciferase reporter gene was used to detect Ln-cRNA-MIAT and miR-519d-3p and the direct effect of miR-519d-3p on EZH2.FTC-133 cells were divid-ed into 6 groups(control group,Empty vector group,LncRNA-MIAT group(LncRNA-MIAT group),miR-519d-3p inhibitor group(miR-519d-3p group),EZH2 inhibitor EPZ-6438 treatment group(EPZ-6438 group),miR-519d-3p inhibitor combined with overexpression of LncRNA-MIAT group(LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor group).Cell proliferation was detected by Edu kit and plate cloning.Apoptosis was detected by flow cytometry.Cell behavior was detected by Transwell cell migration and invasion assay.Re-sults:The expressions of LncRNA-MIAT and EZH2 in thyroid carcinorna tissues and cells were up-regula-ted,and there was a positive correlation between the two(r=0.466,P0.05).The expression of miR-519d-3p was down-regulated in FTC-133 cells(P0.05).Double luciferase reporter assay showed that the tar-get gene of miR-519d-3p was EZH2,and LncRNA-MIAT targeted inhibition of miR-519d-3p to activate EZH2.Compared with Empty vector group,the percentage of Edu positive cells,the number of cell clones,the number of cell invasion and migration in LncRNA-MIAT group and miR-519d-3p inhibitor group were significantly up-regulated(P0.05),and the cell apoptosis rate was decreased(P0.05).EZH2 inhibitor EPZ-6438 decreased the percentage of Edu positive cells,the number of cell clones,the number of cell inva-sion and migration(P0.05),and increased the rate of apoptosis(P0.05).Compared with LncRNA-MI-AT group or miR-519d-3p inhibitor group,the Edu positive cell percentage,cell clone number,cell invasion and migration number of LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor group were significantly up-regulated(P0.05),respectively.The apoptosis rate was decreased(P0.05).Conclusion:LncRNA-MIAT can pro-mote the malignant behavior of thyroid cancer by inhibiting the activation of EZH2 by miR-519d-3p.【Key words】Thyroid carcinoma;LncRNA-MIAT;miR-519d-3p;Histone methylated transfer-ase 2;Cell malignant behavior 甲状腺癌(thyroid cancer,THCA)是最常见的内分泌恶性肿瘤之一,近30 年来其发病率持续上升1。尽管大多数甲状腺癌患者表现出良好的生存,但据报道,初次手术治疗后的复发率为 8%至 23%,这极大地影响了患者的生活质量2。近年来,研究表明,由于基因组不稳定或表观遗传标记改变导致的基因异常表达在甲状腺癌的调控中起着重要作用3。在众多理论中,竞争内源性 RNA(competing endogenous RNA,ceR-NA)假说尤其受到人们的关注,这一假说描述一个由微小 RNA(microRNA,miRNA)介导的复杂的转录后调控网络:通过共享一个或多个 miRNA 响应元件,长链非编码 RNA(LncRNA)竞争性地与 miRNA 的结合,从而在功能上释放了受 miRNA 调控的靶 mRNA4。然而,目前甲状腺癌中的 ceRNA 机制还不十分清楚,需要进一步的研究。心肌梗死相关转录物 LncRNA(Ln-cRNA-MIAT)是一种关键的促癌基因,已被研究证实在多种癌症中表达增高,而且可以参与调控肝癌和胃癌等恶性肿瘤的进展5。然而,LncRNA-MIAT 在甲状腺癌中的作用与机制仍不十分清楚。本研究通过TCGA 数据库(https:/www.cancer.gov/about-nci/or-ganization/ccg/research/structural-genomics/tcga)、Starbase(https:/ LncRNA-MIAT 相关的 ceRNA 网络中涉及 28 个 miRNA 和 203 个 mRNA,其中在 TCGA 数据中 miR-519d-3p 在甲状腺癌中极低表达,而且 MI-AT 和其中的 EZH2 在包括甲状腺癌在内的多种类型癌症中呈极显著正相关关系。因此我们假设 LncRNA-MIAT 可能在甲状腺癌中扮演促癌作用,且存在 Ln-cRNA-MIAT-miR-519d-3p-EZH2 这条调控网络,并且本文通过体外实验研究了 LncRNA-MIAT 对甲状腺癌细胞恶性行为的调控作用并初步探讨了机制。1 材料与方法1.1 细胞与主要试剂:人正常甲状腺细胞系 Nthy-ori 3-1 和人甲状腺癌细胞系 FTC-133 均购自中国科学院典型培养物保藏中心。胎牛血清(FBS)、DMEM 培4321 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 养基均购自美国 Gibco 公司。兔抗 EZH2 抗体、GAP-DH 抗体、辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗兔 IgG二抗均购自英国 Abcam 公司。用于阻断 EZH2 活性的EPZ-6438 购于美国 MCE 公司。免疫荧光原位杂交试剂盒购于上海碧云天公司。Cy3 标记的抗小鼠二抗和 Cy3 标记的抗兔二抗均购于美国 Abcam 公司。1.2 方 法1.2.1 细胞培养和分组:细胞培养 FTC-133 细胞和 Nthy-ori 3-1 细胞用含有 10%FBS 的 DMEM 培养基,置于 37、5%CO2细胞培养箱中培养。FTC-133 细胞的转染和分组:分别将 LncRNA-MIAT 过表达载体(pcDNA3.1-LncRNA-MIAT,LncRNA-MIAT)、空载体(Empty vector)(均由上海吉玛公司进行构建)转染至 FTC-133 细胞,分别命名为 LncRNA-MIAT组、Empty vector 组。将 miR-519d-3p inhibitor(购于上海吉玛公司)转染至 FTC-133 细胞,命名为 miR-519d-3p inhibitor 组。用 APTO-263 处理 FTC-133 细胞,命名为 APTO-263 组。另外,将 LncRNA-MIAT 过表达载体和 miR-519d-3p inhibitor 联合转染 FTC-133 细胞,命名为 LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhib-itor 组。每组均孵育 24h。进行后续检测。1.2.2 实时定量 PCR:收集细胞的总 RNA,逆转录为cDNA,行 PCR 扩增。以 GAPDH 为内参,采用 2-CT法计算 LncRNA-MIAT、miR-519d-3p、EZH2 mRNA的相对表达量。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,序列见表 1。表 1 PCR 引物序列基因序列LncRNA-MIAT5-CGTCCGACCGGATTCACA-35-TCCATCCCCACTGGGCACT-3EZH25-ATTCCGATGTGTAGGATG-35-TGTCTAACTCAAGCTGCTTCG-3miR-519d-3p5-CTGATCCGGGACGTGGACCT-35-TAGGGCCAGAGGGCGGATTA-3GAPDH5-TTCCGACAGGATGCAGA-35-GCCGATCCACACGGAGTACT-3U65-TCACTCCACGGTCGTACTT-35-GCAGATCCTCACCGATTACGG-31.2.3FISH 实验:CY3 标记的 LncRNA-MIAT 探针由广州瑞博生物有限公司设计合成。4%多聚甲醛固定 FTC-133 细胞,与含有 LncRNA-MIAT 探针的杂交缓冲液在 37 暗处杂交过夜。用 DAPI(北京 Solari-bo)染细胞核。在荧光显微镜下观察切片。1.2.4 Western blot:提取各组细胞的总蛋白质。通过BCA 蛋白检测试剂盒检测总蛋白浓度。然后实施 SDS-PAGE 分离蛋白质:70V 30min 转 120V 90min。然后将蛋白条带以 300mA 转移到 PVDF 膜上。在室温下用 5%脱脂牛奶封闭 2h 后,将膜与一抗在 4 下孵育过夜:anti-EZH2(1 1000),anti-GAPDH 抗体(1 2500)。然后,将膜与 HRP 偶联的山羊抗兔 IgG(1 2000)孵育 1h。用 ECL 检测试剂显示蛋白条带,并用ImageJ 软件分析每个条带的灰度值。1.2.5双荧光素酶报告基因实验:合成含 LncRNA-MIAT 野生型(MIAT-wt)或突变型(MIAT-mut)结合位点的 DNA 片段,克隆到 pMIR-GLO 荧光素酶载体。分离重组质粒并测序。将 miR-519d-3p mimics 和mimics NC 分别按照说明书使用 Lipofectamine3000与 MIAT-wt/MIAT-mut 片段共转染 FTC-133 细胞。转染 4h 后,更换培养基,将细胞置于 37、5%CO2培养箱中培养 48h。用双荧光素酶试剂盒检测各组的荧光素酶活性。另外,将合成的 EZH2 3 UTR 野生型(EZH2-wt)或突变型(EZH2-mut)与 miR-519d-3p mimics 和 mimics NC 分别共转染 FTC-133 细胞,以检测 miR-519d-3p 都与 EZH2 的调控作用,其余实验方法同上。1.2.6 5-乙炔基-2-脱氧尿苷(EdU)染色实验:各组细胞用含 50M EdU 试剂(美国 RiboBio)的 DMEM培养基在 37、5%CO2下孵育 2h。用 PBS 洗涤 2次,用 4%多聚甲醛固定 30min,用 2mg/mL 甘氨酸溶液中和,加入100L 0.5%Triton X-100 进行通透性处理。PBS 洗涤后,每孔加入 100L 1Apollo 染料,室温孵育 30min。随后加入 100L DAPI,继续孵育10min,并在荧光显微镜下进行拍照。1.2.7 平板克隆形成实验:将各组 FTC-133 细胞浓度调整为 1103个/mL,培养在 6 孔板上,进行 14d 的常规培养,每隔 3d 换液一次,用甲醇固定并染色,对克隆计数并进行统计。1.2.8流式细胞术:采用 ACSVerse(美国 BD 公司)流式细胞仪对各组细胞进行进行 Annexin V-FITC 和PI 染色。收集细胞并将细胞密度调整为 5105,总体积为 200L,再次离心弃掉上清,加入 500L 1Bind-ing Buffer,轻轻重悬细胞。随后加入 5L Annexin V-5321 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 FITC 和 5L PI 轻轻混匀,室温避光下孵育 15min,并用流式细胞仪进行检测。1.2.9 Transwell 侵袭和迁移实验:细胞侵袭实验预先在上室膜(孔径为 8m)用基质胶涂层,将细胞(5104/mL)悬浮在含无血清培养基的 Transwell 上室中,而下室充满含有 20%FBS 的培养基。孵育 48h,去除上表面的剩余细胞,并固定膜下表面细胞,用结晶紫染色,在光学显微镜下(40 x 放大倍数)计数。细胞迁移实验除不预先对上室膜进行基质胶涂层外,其余同细胞侵袭实验。1.3统计学分析:本研究的数据都使用 GraphPad PRISM 5.01 进行数据录入和统计学分析。正态分布的数据表示为平均值标准差(xs)。两组间的数据差异用 t 检验。单因素方差分析(ANOVA)评估平均值之间的差异,并进行 LSD-t 的多重比较,以评估两组之间的统计差异。检验水准为=0.05,P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 LncRNA-MIAT 在甲状腺癌中的表达:从 TCGA数据库中获取甲状腺癌中的基因表达数据,观察到与癌旁正常组比,THCA 组的 LncRNA-MIAT 的表达升高 1.5 倍(t=2.664,P=0.008),见图 1A。另外,qPCR结果显示,与 Nthy-ori 3-1 组(1.000.05)比,FTC-133 组(4.120.31)中 LncRNA-MIAT 的表达增加3.2倍(t=17.210,P=2.5e-6),见图 1B。通过 FISH 法检测人甲状腺癌细胞系 FTC-133 中 LncRNA-MIAT 的定位,结果显示,LncRNA-MIAT 主要定位在细胞质内,见图 1C。2.2甲状腺癌中 LncRNA-MIAT 下游靶点的预测和表达验证:从 TCGA 数据库中获取甲状腺癌中的差异表达的 miRNA 和靶基因表达数据集,结合 targetscan和 starbase 在线分析的 miRNA-target 和 LncRNA-miR-NA 调控关系网络进行综合预测和分析,最终将甲状腺癌中 LncRNA-MIAT 下游靶点确定为 miR-519d-3p和 EZH2。TCGA 数据库中观察到甲状腺癌中 EZH2 mRNA 的水平表达升高 1.29 倍(t=19.352,P=1.21e-11)。而且甲状腺癌中 LncRNA-MIAT 与 EZH2 的表达水平呈显著正相关(r=0.466,P=8.4e-29)。qPCR法检测 Nthy-ori 3-1 和 FTC-133 中 miR-519d-3p 的表达,结果显示,与 Nthy-ori 3-1 组比,FTC-133 组中miR-519d-3p 的表达降低 92.3%(t=64.969,P=5.6e-15),而与 Nthy-ori 3-1 组比,FTC-133 组中 EZH2 的mRNA 表达和蛋白表达水平都上调,差异有统计学意义(t=23.461 和 19.729,P=1.5e-10 和 2.3e-5)。图 1 甲状腺癌中 LncRNA-MIAT 的表达A:TCGA 数据库中 THCA 组织和癌旁正常组织中 LncRNA-MIAT 表达的比较。B:qPCR 法检测人正常甲状腺细胞系 Nt-hy-ori 3-1 和人甲状腺癌细胞系 FTC-133 中 LncRNA-MIAT 的表达,与 Nthy-ori 3-1 组比,P0.0001。C:FISH 实验检测 FTC-133 中 LncRNA-MIAT 的定位(FISH 染色,200,标尺=50m,红色荧光:CY3 标记的 LncRNA-MIAT,蓝色荧光:DAPI 标记的细胞核)。图 2 甲状腺癌中 LncRNA-MIAT 下游靶点的预测和表达验证A:TCGA 数据库中 THCA 组织和癌旁正常组织中 EZH2 6321 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 mRNA 表达的比较。B:TCGA 数据库中的 THCA 组织中 Ln-cRNA-MIAT 和 EZH2 mRNA 的相关性。C 和 D:qPCR 法检测人正常甲状腺细胞系 Nthy-ori 3-1 和人甲状腺癌细胞系 FTC-133 中 miR-519d-3p 和 EZH2 mRNA 的表达,与 Nthy-ori 3-1 组比,P0.0001;与 Nthy-ori 3-1 组比,P0.05,图3C),而 miR-519d-3p 的表达明显下调,EZH2 的表达明显上调(t=12.054 和 15.421,P=0.002 和 0.001,图 3D-3E)。用 EZH2 的抑制剂 EPZ-6438 处理 FTC-133 细胞,对 miR-519d-3p 和 LncRNA-MIAT 的表达均无影响(P0.05,图 3C 和图 3D),可以明显抑制EZH2 的表达(t=7.885 和 9.524,P=0.009 和 0.008,图 3D-3E)。与 LncRNA-MIAT 组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor 组的 LncRNA-MIAT 的表达无明显变化(P0.05,图 3C),而 miR-519d-3p 的表达被进一步抑制,EZH2 的表达则被显著上调(t=5.887和 6.251,P=0.019 和 0.011,图 3D-3E)。另外,与miR-519d-3p inhibitor 组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor 组的 miR-519d-3p 的表达被进一步抑制,EZH2 的表达则被显著上调(t=8.207 和 4.984,P=0.005 和 0.016,图 3D-3E)。图 3 甲状腺癌中 LncRNA-MIAT、miR-519d-3p 和 EZH直接关系的实验验证A:荧光素酶报告基因实验检测 LncRNA-MIAT 和 miR-519d-3p 的直接作用。B:荧光素酶报告基因实验检测 EZH2 3-UTR 和 miR-519d-3p 的直接作用。C-E:qPCR 分别检测各组 LncRNA-MIAT、miR-519d-3p、EZH2 mRNA 的表达。与 Control 组比,P0.05;#与 LncRNA-MIAT 组比,P0.05。&与 miR-519d-3p inhibitor 组比,P0.05。2.4LncRNA-MIAT 通过抑制 miR-519d-3p 激活EZH2 调控甲状腺癌细胞的增殖:与 Empty vector 组相比,LncRNA-MIAT 组的 EdU 阳性细胞百分比和克隆细胞数均显著上调(P 0.05)。FTC-133 细胞转染miR-519d-3p inhibitor 后,观察到 Edu 阳性细胞百分比和克隆细胞数均显著上调(P0.05)。EZH2 的抑制剂 EPZ-6438 则明显抑制 EdU 阳性细胞百分比和克隆细胞数(P0.05)。与 LncRNA-MIAT 组比,Ln-cRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor 组的 Edu 阳性细胞百分比和克隆细胞数均显著上调(P 0.05)。与miR-519d-3p inhibitor 组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor 组的 EdU 阳性细胞百分比和克隆细胞数均显著上调(P0.05)(图 4A-4D)。7321 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 图 4 LncRNA-MIAT 通过抑制 miR-519d-3p 激活 EZH2调控甲状腺癌细胞增殖A:Edu 实验检测细胞的增殖(EdU 染色,100,标尺=50m,红色荧光:EdU 标记的增殖活性细胞,蓝色荧光:DAPI标记的细胞核)。B:平板克隆实验检测细胞的生长能力。C:EdU 阳性细胞的统计结果。D:细胞克隆数目的统计结果。与 Control 组比,P0.05;#与 LncRNA-MIAT 组比,P0.05。&与 miR-519d-3p inhibitor 组比,P0.05。2.5LncRNA-MIAT 通过抑制 miR-519d-3p 激活EZH2 调控甲状腺癌细胞的凋亡:与 Empty vector 组相比,LncRNA-MIAT 组的细胞凋亡率显著下调(P0.05)。FTC-133 细胞转染 miR-519d-3p inhibitor 后,观察到细胞凋亡率显著下调(P0.05)。而 EZH2 的抑制剂 EPZ-6438 明显增加了细胞的凋亡率(P0.05)。与 LncRNA-MIAT 组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor 组的细胞凋亡率显著下调(P 0.05)。与 miR-519d-3p inhibitor 组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor 组的细胞凋亡率也显著下调(P0.05)(图 5)。图 5 LncRNA-MIAT 通过抑制 miR-519d-3p 激活 EZH2调控甲状腺癌细胞的凋亡A:流式细胞实验检测细胞的凋亡。B:细胞凋亡率的统计结果。与 Control 组比,P0.05;#与 LncRNA-MIAT 组比,P0.05。&与 miR-519d-3p inhibitor 组比,P0.05。2.6LncRNA-MIAT 通过抑制 miR-519d-3p 激活EZH2 调控甲状腺癌细胞的侵袭和迁移:与 Empty vec-tor 组相比,LncRNA-MIAT 组的细胞侵袭数和细胞迁移数显著上调(P0.05)。FTC-133 细胞转染 miR-519d-3p inhibitor 后,观察到细胞侵袭数和细胞迁移数显著上调(P0.05)。而 EZH2 的抑制剂 EPZ-6438明显减少了细胞侵袭数和细胞迁移数(P0.05)。与LncRNA-MIAT 组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor 组的细胞侵袭数和细胞迁移数显著下调(P0.05)。与 miR-519d-3p inhibitor 组比,LncRNA-MI-AT+miR-519d-3p inhibitor 组的细胞侵袭数和细胞迁移数也显著下调(P0.05)(图 6A-6C)。图 6 LncRNA-MIAT 通过抑制 miR-519d-3p 激活 EZH2调控甲状腺癌细胞的侵袭和迁移A:Transwell 法检测细胞侵袭和迁移(结晶紫染色,200,标尺=50m)。B:细胞侵袭数目的统计结果。C:细胞迁移数目的统计结果。与 Control 组比,P0.05;#与 LncRNA-MIAT组比,P0.05。&与 miR-519d-3p inhibitor 组比,P0.05。3 讨 论甲状腺癌患者的预后通常较为良好,因为手术或者放射性碘治疗,在大多数情况下都可以实现完全改善5。然而,目前的诊断和治疗策略并不完全有效。8321 第 29 卷 第 8 期2023 年 8 月 河 北 医 学HEBEI MEDICINE Vol.29,No.8Aug.,2023 在过去的几十年里,研究人员已经确定甲状腺肿瘤发生是一个复杂的生物学过程,其特征是多种非编码RNA 分子的异常表达,主要包括 miRNA 和 LncRNA,这些分子在过去十年中被多次提出可作为癌症通路的调节因子,并有作为癌症预后生物标志物的潜力6。我们发现在甲状腺癌细胞系中 LncRNA-MIAT 表达明显上调,而 miR-519d-3p 明显下调。而且在本研究中,通过双荧光素酶基因报告法我们发现在甲状腺癌细胞中 LncRNA-MIAT 与 miR-519d-3p 相互作用,从而调控了 EZH2 信号,这在甲状腺癌的发生发展中具有重要作用。LncRNA-MIAT 最初被认为与心肌梗死相关,但研究表明沉默 MIAT 显著抑制内皮细胞增殖和迁移7。研究人员发现 LncRNA-MIAT/miR-150-5p/ZEB1 信号通路在非小细胞肺癌中起致癌作用8。而且,LncRNA-MIAT 通过与 miR-361-3p 的结合,可以促进前列腺癌的发展,下调 LncRNA-MIAT 通过上调miR-361-3p 的表达抑制前列腺癌细胞的活力并诱导细胞凋亡9。表明,LncRNA-MIAT 是一种促癌基因,可以通过调控 miRNA 促进肿瘤的进展。本研究在甲状腺癌中同样证实了是一种促癌基因,促进了癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并抑制细胞凋亡,这种功能与其直接靶点 miR-519d-3p 密切相关,因为 LncRNA-MI-AT 过表达和 miR-519d-3p inhibitor 的功能几乎一致,均促进了癌细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制了细胞凋亡。因此,我们的研究表明,LncRNA-MIAT 通过抑制miR-519d-3p 促进了甲状腺癌的进展。EZH2 是本研究中的另一个关键靶点。它是多梳抑制复合体 2 的核心成分之一,多梳抑制复合体的作用是赖氨酸甲基转移酶,特别是催化 H3K27me3 的甲基化10。EZH2 表达升高在包括甲状腺癌在内的多种癌症中均被广泛认可,其表达与肿瘤恶性、侵袭性和不良预后密切相关。LncRNA 已被证明可以通过转录后机制直接或间接地调节 EZH2 的水平。如在胃癌中,LINC00673 通过与 LSD1 和 EZH2 相互作用调节致癌生物学行为11。而 miRNA 则可以与 EZH2 mRNA 转录本结合,调控其稳定性、完整性和翻译,从而直接影响 EZH2 蛋白的表达。例如,miR-101-3p 通过转录后下调 EZH2,降低多种肿瘤类型的侵袭和迁移能力,包括成神经管细胞瘤和食管鳞状细胞癌12,13。总的来说,这些观察结果是我们关于 LncRNA-MIAT、miR-519d-3p 和 EZH2 之间关系猜想的基础。本研究通过双荧光素酶报告实验证实了中 LncRNA-MIAT 与 miR-519d-3p 的靶向关系以及 miR-519d-3p 与 EZH2 的靶向关系。并且通过抑制 EZH2 对甲状腺癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响与 miR-519d-3p inhibitor和过表达 LncRNA-MIAT 明显相反。而且 miR-519d-3p inhibitor 可以上调 EZH2 的表达,LncRNA-MIAT 过表达也可以抑制 miR-519d-3p 并上调 EZH2 的表达。因此,这表明,LncRNA-MIAT 可以通过抑制 miR-519d-3p 上调 EZH2,从而促进甲状腺癌细胞增殖、迁移、侵袭并抑制细胞凋亡。综上所述,甲状腺癌中 LncRNA-MIAT 表达显著增加,过表达 LncRNA-MIAT 抑制甲状腺癌细胞凋亡,促进甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭行为,其关键分子机制是通过抑制 miR-519d-3p 上调 EZH2 的表达。我们的研究为 LncRNA-MIAT 在癌症中的作用提供了新的见解,并可能有助于甲状腺癌治疗和诊断诊断工具的开发。【参考文献】1Cui Y,Mubarik S,Li R,et al.Trend dynamics of thyroid cancer incidence among China and the US adult population from 1990 to 2017:a joinpoint and age-period-cohort analy-sisJ.BMC Public Health,2021,21(1):1-13.2 Lin RX,Yang SL,Jia Y,et al.Epigenetic regulation of papil-lary thyroid carcinoma by long non-coding RNAsJ.Semin Cancer Biol,2022,83:253-260.3Gugnoni M,Manicardi V,Torricelli F,et al.Linc00941 is a novel transforming growth factor beta target that primes pa-pillary thyroid cancer metastatic behavior by regulating the expression of cadherin 6J.Thyroid,2021,31:247-263.4 Alkan AH,Akgul B.Endogenous miRNA spongesJ.Meth-ods Mol Biol,2022,2257