大肠杆菌L-苏氨酸脱氢酶的高效表达及其酶学性质分析.pdf
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1、生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 85大肠杆菌L-苏氨酸脱氢酶的高效表达及其 酶学性质分析刘欣欣1,王 瑶1,史红玲1,姚伦广1,王 贤2,唐存多1,2,3,*(1.南阳师范学院生命科学与农业工程学院,河南 南阳 473061;2.赊店老酒股份有限公司博士后创新实践基地,河南 南阳 473300;3.河南农业大学食品科学技术学院,河南 郑州 450002)摘 要:为提高L-苏氨酸脱氢酶(L-threonine dehydrogenase,L-TDH)催化L-苏氨酸脱氢合成L-2-氨基乙酸乙酯效率,通过基因挖掘的手段挖掘出来自大肠杆菌(Escherichia coli)的L
2、-TDH,再借助pACYCDuet-1表达系统将其在E.coli BL21(DE3)中进行可溶性表达及鉴定。结果表明,L-TDH在E.coli BL21(DE3)中实现了高水平的可溶性表达,其裂解液中的酶活力为19.13 IU/mL,约为E.coli BL21(DE3)本底表达水平的79 倍。纯化后的比活力为12.77 IU/mg,它的最适反应温度为45,最适反应pH值为9.0,在35 和40 保温120 min,残留酶活力仍能达到90%以上。此外,EcTDH动力学参数也优于其他已报道的L-TDH,在转化L-苏氨酸合成2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine,2,5-DMP
3、)的过程中具有更大优势,也为实现转化L-苏氨酸合成2,5-DMP的工业化生产奠定了理论基础。关键词:L-苏氨酸;L-苏氨酸脱氢酶;大肠杆菌;表达;生物转化Efficient Expression and Enzymatic Properties of L-Threonine Dehydrogenase from Escherichia coli LIU Xinxin1,WANG Yao1,SHI Hongling1,YAO Lunguang1,WANG Xian2,TANG Cunduo1,2,3,*(1.College of Life Science and Agricultural Eng
4、ineering,Nanyang Normal University,Nanyang 473061,China;2.Postdoctoral Innovation Practice Base,She Dian Lao Jiu Co.Ltd.,Nanyang 473300,China;3.College of Food Science and Technology,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)Abstract:Our aim was to improve the catalytic efficiency of L-th
5、reonine dehydrogenase(L-TDH)on L-threonine dehydrogenation to synthesize ethyl L-2-aminoacetate.An L-TDH gene from Escherichia coli was mined and solubly expressed in E.coli BL21(DE3)through pACYCDuet-1 expression system.The expressed enzyme was purified and characterized.The results showed that hig
6、h-level soluble expression of L-TDH was achieved in E.coli BL21(DE3),and the enzyme activity in the lysate was 19.13 IU/mL,which was about 79 times higher than that the level of E.coli BL21(DE3)background expression.The specific activity of the purified L-TDH was 12.77 IU/mg;its optimal reaction tem
7、perature was 45,and its optimal reaction pH was 9.0.The residual enzyme activity was still more than 90%after being held at 35 or 40 for 120 min.In addition,the kinetic parameters of EcTDH were better than those of other reported L-TDHs,and EcTDH was superior in the synthesis of 2,5-dimethylpyrazine
8、(2,5-DMP)by converting L-threonine.Our findings could lay a theoretical foundation for the industrial production of 2,5-DMP.Keywords:L-threonine;L-threonine dehydrogenase;Escherichia coli;expression;biotransformationDOI:10.7506/spkx1002-6630-20221206-055中图分类号:Q814.9 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)18-00
9、85-08引文格式:刘欣欣,王瑶,史红玲,等.大肠杆菌L-苏氨酸脱氢酶的高效表达及其酶学性质分析J.食品科学,2023,44(18):85-92.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221206-055.http:/收稿日期:2022-12-06基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(31900916);河南省高校科技创新人才项目(21HASTIT041);河南省青年人才托举工程项目(2021HYTP036)第一作者简介:刘欣欣(1998)(ORCID:0000-0003-1554-5655),女,硕士研究生,研究方向为生物催化与生物转化。E-mail:*通信作者简介:
10、唐存多(1987)(ORCID:0000-0003-0352-0805),男,副教授,博士,研究方向为生物催化与生物转化。E-mail:86 2023,Vol.44,No.18 食品科学 生物工程LIU Xinxin,WANG Yao,SHI Hongling,et al.Efficient expression and enzymatic properties of L-threonine dehydrogenase from Escherichia coliJ.Food Science,2023,44(18):85-92.(in Chinese with English abstract)
11、DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221206-055.http:/2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine,2,5-DMP)是一种杂环含氮化合物,广泛存在于各种食品中,是食品中重要的香气化合物1。由于2,5-DMP具有增香作用,它作为食品工业中的食品添加剂受到了广泛关注。天然的2,5-DMP常存在于热处理后原料种子2、烤牛肉3、白醋4、酒5-6、酱油7、咖啡豆8-9、烤花生10-11、乌龙茶12 以及发酵大豆13中,具有炒花生香气和巧克力、奶油风味,是食品工业中不可缺少的调味添加剂。同时,2,5-DMP还被应用于制药工业,是生产降糖类药物和抗脂类药物
12、的重要底物,如5-甲基吡嗪-2-羧酸是合成抗脂分解药物中间体的合成原料14,常用于合成抗高血压类药物阿莫西林、降血糖血脂类药物格列吡嗪以及抗结核药物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯等15-16。L-苏氨酸是一种必需氨基酸,可用于食品增香剂、医药、饲料添加等方面17。目前,安全绿色且广泛使用的生产方法是微生物发酵法18。近年来,L-苏氨酸的生产过热,导致出现了产能严重过剩的窘境19。因此,L-苏氨酸的转产增值迫在眉睫,其途径主要有以下几种:一是以L-苏氨酸为底物,经过多酶级联反应进行脱氨和还原生成L-氨基丁酸,同时还原反应所消耗的NADH通过甲酸脱氢酶再生20。二是以L-苏氨酸为底物,利用L-苏氨酸脱
13、氢酶(L-threonine dehydrogenase,L-TDH)使L-苏氨酸脱氢生成L-2-氨基乙酰乙酸,经过一系列自发反应生成2,5-DMP。三是L-苏氨酸在苏氨酸醛缩酶的作用下直接生成甘氨酸。本研究拟挖掘鉴定出高活性的L-TDH,试图以L-苏氨酸为底物采用全细胞催化法生产2,5-DMP,实现L-苏氨酸的转产增值,力争解决苏氨酸产能过剩问题12,14。在大肠杆菌(Escherichia coli)中,2,5-DMP可以由L-苏氨酸天然合成,全细胞催化途径中的催化过程为L-苏氨酸在L-TDH的作用下转化为L-2-氨基乙酰乙酸21,L-TDH是催化过程中的关键酶22。已有文献报道,来源于E
14、.coli的L-TDH借助pET28a载体在E.coli中实现了可溶性表达,其比活力约为132 mU/mg。曹艳丽等19经枯草芽孢杆菌外源表达了来源不同的L-TDH,结果表明,来源于E.coli K-12的L-TDH在枯草芽孢杆菌中更有利于L-苏氨酸合成2,5-DMP,但其L-TDH活力仅为0.024 IU,比活力为0.15 IU/mg。本研究拟以E.coli为出发菌株,从中调取L-TDH基因,再借助pACYCDuet-1质粒强化其在E.coli BL21(DE3)的表达,并对其酶学性质进行分析,旨在为提高苏氨酸转化为L-2-氨基乙酰乙酸效率提供参考。1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1
15、 试剂限制性内切酶BamH I和Hind III New England Biolabs(北京)公司;L-苏氨酸 美国Sigma-Aldrich公司;2,5-DMP、2,4-二硝基氟苯 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;NAD 日本Chem-Station公司;异丙基-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)Master of Bioactive Molecules(北京)公司;Prime STAR HS(Premix)、DL 2000 DNA Marker、rTaqDNA聚合酶、PrimeScript II 1st Strand cDNA
16、Synthesis Kit、DNA连接试剂盒Ver.2.1 宝生物工程(大连)有限公司;甲醇、甲酸(均为色谱纯)天津科密欧化学试剂有限公司;其他试剂均为国产分析纯。1.1.2 菌株与质粒本研究所涉及到的菌株和质粒如表1所示,重组质粒的构建如图1所示。表 1 本研究用到的菌株和质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study菌株和质粒特征来源菌株E.coli BL21(DE3)克隆宿主和表达宿主本实验室保藏E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1 E.coli BL21(DE3)菌株携带质粒pACYCDuet-1本研究构建E.co
17、li BL21(DE3)/pACYCDuet-1-EctdhE.coli BL21(DE3)菌株携带质粒pACYCDuet-1-Ectdh,TDH的外源表达本研究构建质粒pACYCDuet-1E.coli表达载体本实验室保藏pACYCDuet-1-Ectdh来源于E.coli BL21(DE3)的TDH的外源表达重组质粒,质粒pACYCDuet-1携带有来源于E.coli BL21(DE3)的Ectdh基因(Cmr)本实验构建pACYCDuet-1pACYCDuet-1-EctdhMCS1MCS1BamH I?Hind IIIBamH I?Hind IIIDNA?EctdhEctdh图 1 重
18、组质粒pACYCDuet-1-Ectdh的构建Fig.1 Construction of the recombinant plasmid pACYCDuet-1-Ectdh生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 871.2 仪器与设备核酸电泳仪、Hypersil C18柱 美国Thermo Fisher公司;UNIVERSAL Hood凝胶成像系统、PowerPacTM HC/Mini-PROTEAN蛋白电泳系统 美国Bio-Rad公司;VCX 130型超声破碎仪 美国Sonics and Materials公司;UV1000紫外-可见分光光度计 梅特勒-托利多科技(中国)有限
19、公司;EC 2006型高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)系统 大连依利特分析仪器有限公司。1.3 方法1.3.1 重组菌株的构建及序列分析从EMBLs European Bioinformatics Institute(https:/www.ebi.ac.uk/)数据库中搜索到一个E.coli来源的L-TDH EcTDH(ACI75701.1)。根据此序列设计扩增Ectdh的特异性引物Ectdh-F:CGCGGATCCGATGAAAGCGTTATCCAAACTG(含 B a m H I 酶 切 位 点)和 E c t d h-
20、R:CCCAAGCTTTTAATCCCAGCTCAGAATAAC(含Hind III酶切位点),委托苏州泓讯生物技术有限公司进行合成。以E.coli BL21(DE3)基因组DNA为模板,利用Ectdh-F和Ectdh-R引物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增Ectdh的编码基因,再利用限制性核酸内切酶BamH I和Hind III对目的基因及载体pACYCDuet-1分别进行双酶切,然后连接转化进入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经氯霉素抗性筛选和测序鉴定获得E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-Ectdh重组
21、菌。将上述重组菌连续在无抗LB培养基上进行培养,然后接种至含氯霉素抗性的LB培养基上培养,观察生长情况,通过氯霉素抗性筛选考察重组菌携带质粒的遗传稳定性23。基于测序结果,通过Jalview对该酶进行多序列比对。1.3.2 重组E.coli诱导重组E.coli的诱导表达采用低温、低浓度诱导剂的方法。分别将E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1、E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-Ectdh单菌落接种至5 mL含100 g/mL氯霉素的LB液体培养基中,37、200 r/min振荡培养14 h,以2%接种量将过夜培养的菌液转接至100 mL新鲜LB液体培养
22、基中,37、200 r/min 培养约2 h至菌体细胞密度(OD600 nm)为1.0,加入1 mol/L IPTG至终浓度为0.1 mmol/L,16、200 r/min诱导培养20 h。将100 mL菌液于8 000 r/min、4 离心510 min,收集菌体,将菌体用20 mmol/L Tris-HCl重悬后进行超声破碎,破碎后收集上清液,上清液通过镍琼脂糖柱上进行纯化,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)进行分析24。1.3.3 酶活力测定诱导表达
23、后的重组菌进行超声破碎,离心取纯化后的上清液,参照文献19并进行略微改动测定重组酶活力。以L-苏氨酸为底物测定EcTDH活力,总的1 mL反应体系包含0.76 mL Tris-HCl(76 mmol/L,pH 7.8)、0.08 mL L-苏氨酸(8 mmol/L)、0.06 mL NAD溶液(3 mmol/L)混匀,放入35 金属浴中预热5 min,加入0.1 mL酶液,测定1 min内OD340 nm的变化值。酶活力定义为1 min内生成1 mol NADH所需的酶量为1 IU25。1.3.4 重组酶的温度特性参照1.3.3节方法,分别在2060(以5 为间隔)下测定重组酶活力以获得重组酶
24、的最适反应温度。将重组酶分别在3555 保温0120 min(以10 min为间隔),在最适反应温度下测定各自的残留酶活力,以冰浴保存各时间段的残留酶活力为100%,考察重组酶的温度稳定性。1.3.5 重组酶的pH值特性参照1.3.3节方法,控制在最适反应温度下,分别在pH 6.510.5(以0.5为间隔)下测定重组酶活力以获得重组酶的最适反应pH值。将重组酶分别在pH 6.510.5(以0.5为间隔)的缓冲液中放置在最适反应温度下保温1.5 h,测定各自的残留酶活力,以未经处理的酶液为100%,考察重组酶的pH值稳定性。1.3.6 重组酶的动力学参数根据已报道的方法稍加修改,测定重组TDH的
25、动力学参数,确定TDH底物的特异性26-27,反应系统中NAD浓度为0.5 mmol/L。最佳反应条件下,在414 mmol/L 不同L-苏氨酸浓度下测定重组酶的催化活性。每次测定重复3 次。同样地,固定L-苏氨酸浓度为10 mmol/L,将NAD浓度设置为0.51.75 mmol/L,测定重组酶的催化活性,每次测定3 次,考察对NAD的动力学参数。所有计算均由Origin 9.0执行,利用Origin 9.0软件进行非线性拟合,得出重组酶对底物的Km、Kcat和Vmax。1.3.7 重组E.coli全细胞转化L-苏氨酸合成2,5-DMP在250 mL三角瓶中构建50 mL的反应体系,体系包括
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