斑节对虾混养池塘微生物群落生态功能初探.pdf
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1、D O I:1 0.1 6 3 7 8/j.c n k i.1 0 0 3-1 1 1 1.2 1 2 6 1第4 2卷第6期2 0 2 3年1 1月水产科学F I S HE R I E S S C I E N C EV o l.4 2N o.6N o v.2 0 2 3斑节对虾混养池塘微生物群落生态功能初探周 磊1,赵泽龙2,关晓燕2,王 摆2,周遵春2(1.中国科协培训和人才服务中心,北京1 0 0 0 3 8;2.辽宁省海洋水产科学研究院,辽宁省海洋水产分子生物学重点实验室,辽宁 大连1 1 6 0 2 3)摘 要:利用宏基因组技术比较斑节对虾单独养殖、斑节对虾与海蜇混养、斑节对虾与海蜇
2、和菲律宾蛤仔混养3种养殖模式池塘沉积物的微生物群落。试验结果显示,皮氏罗尔斯通氏菌为最主要的致病菌,斑节对虾养殖池塘沉积物中致病菌的丰度相比于对照组沉积物均明显下降。与非海水养殖池塘对照沉积物相比,斑节对虾养殖池塘沉积物的微生物群落中硝酸盐还原生成氨氮的相关基因以及硫酸盐还原产生硫化氢的相关基因含量更高,而亚硝酸盐和氨氮利用基因含量较低。3种斑节对虾养殖模式中,斑节对虾单独养殖和斑节对虾与海蜇和菲律宾蛤仔混养池塘沉积物中硝酸盐和硫酸盐还原基因丰度均高于斑节对虾与海蜇混养模式。此外,斑节对虾养殖池塘沉积物中,一些特定的生物地球化学循环过程由包括交替单胞菌、拟杆菌、着色菌、黄杆菌、脱硫杆菌和脱硫弧
3、菌等多种微生物共同完成。探明不同斑节对虾养殖池塘微生物群落中潜在的人类致病菌情况以及氮、硫等基本元素的生物地球化学循环,对于优化养殖技术、控制疾病暴发同时提高养殖产量具有重要意义。关键词:混合养殖;斑节对虾;宏基因组;致病微生物;生物地球化学循环中图分类号:S 9 1 7.1文献标识码:A文章编号:1 0 0 3-1 1 1 1(2 0 2 3)0 6-0 9 2 1-1 2收稿日期:2 0 2 1-1 2-2 4;修回日期:2 0 2 2-0 6-2 3.基金项目:国家重点研发计划项目(2 0 1 8 Y F D 0 9 0 1 6 0 4);辽宁省中央引导地方科技发展项目(2 0 1 9
4、4 1 6 0 3 4);辽宁省海洋与渔业科研项目(2 0 1 8 3 3).作者简介:周磊(1 9 8 8),男,高级工程师;研究方向:科技人才.E-m a i l:m o a z h o u l e i 1 6 3.c o m.通信作者:赵泽龙(1 9 9 0),男,助理研究员,研究方向:海洋微生物.E-m a i l:z z l 2 5 1 61 6 3.c o m.为了提高养殖产量,部分海水养殖过程中会人为投加大量的饵料1,但饵料并不会完全被养殖动物利用,在海水养殖池塘中有超过3 0%的饵料在养殖池底部沉积2。过量的营养物质在养殖池沉积物中长期富集会破坏养殖系统的生态平衡,造成养殖池塘
5、 环 境 的 富 营 养 化,最 终 导 致 养 殖 动 物 死亡3。除养殖苗种质量和人工养殖技术外,养殖环境中的微生物在养殖物种生长和营养物质循环中同样发挥重要作用4-5。在海水池塘养殖过程中,养殖池溏内产生的氨氮和硫化氢等也是影响养殖物种生长和存活的重要因素6-7。环境中的氨氮主要来自于氮循环,它是有机物循环的重要步骤,包含由不同微生物介导的氮固定、氨化作用、硝化及反硝化作用等多个过程8。硫化氢主要来自于硫循环,其为由硫酸盐还原菌和硫化氢氧化菌介导的多个氧化还原步骤组成的硫酸盐和硫化氢相互转化过程9。此外,养殖池塘内过高的养殖密度和营养水平,都可以造成致病微生物的大量繁殖,进而引起疾病暴发
6、和养殖物种的大量死亡1 0。目前已有学者在海水养殖池塘内鉴定到多种引发养殖物种疾病的致病微生物,养殖池塘内致病微生物的水平已 经 成 为 评 估 养 殖 池 疾 病 暴 发 风 险 的 有 效指标1 1。斑节对虾(P e n a e u sm o n o d o n)作为我国沿海的一种非常重要的经济型养殖物种1 2,已被开发出多种混养模式1 3-1 4。早期针对混合养殖的研究主要集中于养殖密度、饲料投喂、混养种类等因素对于养殖产量的影响1 5-1 6,同时,混合养殖模式的营养物质利用效率也受到了广泛的关注1 7。而近期的研究发现,无脊椎动物的混养能够抑制细菌的增殖和生物膜的形成,从而降低养殖池
7、内部疾病的暴发风险1 8。虽然已有研究开始关注养殖环境微生物群落在对虾生长和疾病中的作用1 9-2 1,在传统、集约型以及半集约型对虾单独养殖系统中氮和硫循环相关的微生物也已有过一些研究2 2-2 3,但是,目前尚未有研究比较不同斑节对虾混养模式中微生物群落组成与功能的差异,微生物群落的动态变化与营养物质循环之间的关系也并不清楚。基于此,笔者选定3种广泛使用的斑节对虾养殖模式,分别为斑节对虾单独养殖、斑节对虾与海蜇(R h o p i l e m ae s c u l e n t a)混养、斑节对虾与海蜇和菲律宾蛤仔(R u d i t a p e sp h i l i p p i n a r
8、 u m)混养,利用宏基因组技术分析养殖池沉积物微生物群落的组成构成和生态功能,以比较不同养殖模式潜在致病菌的差异,并通过对不同养殖模式微生物群落生态功能的研究及对微生物群落氮和硫循环功能的详细分析,探索混养模式在营养物质循环方面的优越性,解 析 混 养 模 式 高 效 营 养 物 质 循 环 的 分 子机制。1 材料与方法1.1 试验区域和样本采集样品采集自辽东湾盘锦市近海一海水养殖区(N4 0.6 7,E1 2 2.0 6)的4种不同斑节对虾混养模式池塘,选定的养殖池塘均稳定运行1年以上,每口池塘面积约6.7h m2。对虾单独养殖模式中斑节对虾的养殖密度4.31 04尾/h m2;斑节对虾
9、和海蜇混养的池塘,斑节对虾和海蜇的养殖密度分别为3.01 04尾/h m2和4.51 03尾/h m2;斑节对虾、海蜇和菲律宾蛤仔混养的池塘,斑节对虾、海蜇、菲律宾蛤仔的养殖密度分别为2.2 51 04尾/h m2、3.1 51 03只/h m2和1.6 71 06枚/h m2。所有池塘均以商用鱼粉为饵料,每日8:0 0和1 6:0 0采用均匀投喂的方式向每口池塘中投加饵料,每次投喂约3 0k g,在养殖过程中,所有池塘严禁使用抗生素。在养殖过程中需要与周围的近海区域发生频繁的水交换,这导致养殖池塘中的水体处于不稳定状态,因此,本试验选择沉积物作为样品以确保试验发现与养殖模式直接相关。沉积物样
10、品于2 0 1 6年6月至7月间采集,每种养殖模式分别采集3口不同池塘的沉积物,与此同时,采集养殖池塘相距至少5 0 0m的近岸沉积物作为非养殖对照样品。应用沉积物采集器分别在每口池塘或对照区的3个不同位置采集沉积物,表层沉积物装入5 0m L灭菌的聚乙烯管中,4 保存并于2 4h内运输至实验室。将每口池塘或对照区的3个沉积物样品混合后分装,每0.4g沉积物样品装入2m L无菌聚乙烯管中,于-8 0 冰箱中保存备用。1.2 D NA提取和宏基因组测序采用MPB i o m e d i c a l sF a s t D NAS P I NK i t f o rS o i l试剂盒提取样品D NA
11、,所有操作均参照试剂盒说明书进行。每个样品分别提取3次D NA后混合,以消除D NA提取过程中的误差,同时也使提取的D NA能够满足后续试验所需。提取后的D NA利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性,采用N a n o P h o t o m e t e rN P 8 0测 定 其 浓 度 和 纯 度。D NA样品保存于-2 0冰箱中,以备后续试验。应用N E B N e x tU l t r aTM D NAL i b r a r yP r e pK i t f o r I l l u m i n a构建宏基因组测序文库,所有操作均参照试剂盒说明书进行,文库构建完成后,使用A g i l e
12、 n tB i o a n a l y z e rH SD NAc h i p检验构建文库的大小是否符合预期。应用c B o t2C l u s t e rG e n e r a t i o nS y s t e m,使用H i s e q3 0 0 0/4 0 0 0C l u s t e rK i t按照接头序列对构建的样品测序文库进行聚类,之后应用I l l u m i n aH i s e q 4 0 0 0平台以P E 1 5 0b p策略进行测序,D NA提取和宏基因组测序过程均在样本采集后2个月内完成。采用I l l u m i n aH i S e q测序平台测序获得的原始数据
13、存在一定比例低质量数据,为了保证后续分析的结果准确可靠,需要对原始的测序数据进行预处理,获取用于后续分析的有效数据。首先去除所含低质量碱基(Q 2 0)超过一定比例(默认设为4 0b p)的数据,之后去除N碱基达到一定比例的数据(默认设为1 0b p),最后去除与接头之间重叠超过一定阈值(默认设为1 5b p)的数据,最终每个样品测序的数据量为1 2G b,共获得大约2 0 0G b的宏基因组数据,测序所得原始数据上传至美国国家生物技术信息中心S R A数据库(检索编号为P R J N A 5 1 2 3 8 4)。1.3 生物信息学分析质量控制后得到的有效序列应用M e t a P h l
14、A n 2工具进行物种分类学注释,除了e值的阈值设置为11 0-1 5以外,其余物种分类学注释的运行参数均为默认参数2 4。通过M e t a P h l A n 2的注释,获得宏基因组数据中注释至种水平的物种分类学信息及其在各个样品中的相对丰度。根据物种分类学注释的结果,参照L i等2 5开发的方法进行潜在致病菌注释,提取M e t a P h l A n 2结果中与致病菌参考数据库名字一致的微生物及其丰度信息,得到的结果即为样品中潜在致病菌的组成及丰度。应用S O A Pd e n o v o2 6对质量控制后的有效序列进行拼接,对于单样品和混合拼接生成的c o n t i g s并过滤掉
15、长度为5 0 0b p以下的片段,使用M e t a G e n e-M a r k2 7识别开放阅读框,去除长度低于1 0 0碱基的开放阅读框,每一个开放阅读框即为一个基因,采用C D-H I T软件2 8进行去冗余,以获得非冗余的初始基因集,默认以9 5%序列一致性和9 0%覆盖率进行聚类,并选取每个聚类中最长的序列为代表性序列,使用D I AMO N D软件2 9将基因集与K E G G数据库进行比对,比对的阈值设置为:e值 1 1 0-5。229水 产 科 学第4 2卷1.4 氮和硫循环功能分析根据宏基因组数据的K E G G注释结果,选择其中属于氮循环(m a p 0 0 9 1 0
16、)和硫循环(m a p 0 0 9 2 0)路径的注释结果,根据K E G G对氮、硫循环中不同过程的划分方式将注释到的基因分类到各子过程中,随后根据各个基因的作用方式(单独发挥作用或与其他基因的表达产物组成多聚体发挥作用)计算各样品中各子过程的基因丰度,具体计算过程参考文献3 0-3 2 的研究结果。将属于氮、硫循环功能基因的核酸序列应用B L A S T X与N R数据库进行比对,排名前5 0的e值0.0 0 1的比对结果应用MAG E N软件3 3采用最近共同祖先(L C A)算法进行分类学注释,物种分类学只注释到科水平,以确保分类学注释的准确性,氮、硫循环过程中某一特定宿主微生物的丰度
17、为该过程中注释到该物种的所有基因丰度之和。2 结果与分析2.1 典型对虾混养池塘沉积物潜在致病菌分析不同养殖池塘沉积物中的潜在致病菌组成结果见表1,在各个样品中共发现2 6种潜在的致病菌,在斑节对虾单养、斑节对虾与海蜇和菲律宾蛤仔混养、斑节对虾与海蜇混养和对照样品中,致病菌的检出数目分别为1 1、1 6、8和7种。相比于对照样品,海水养殖沉积物中致病菌的多样性均有所提高,但致病菌的总丰度均有所降低,无论在斑节对虾养殖池塘还是对照组沉积物中,主要致病菌均是皮氏罗尔斯通氏菌(R a l s t o n i ap i c k e t t i i)。表1 各样品中潜在致病菌的名称及丰度 T a b.1
18、 T h e r e l a t i v ea b u n d a n c eo fp o t e n t i a l p a t h o g e n i cb a c t e r i a i nm a r i c u l t u r ea n dc o n t r o l s e d i m e n t s致病菌P a t h o g e n i cb a c t e r i u m致病菌相对丰度/%T h er e l a t i v ea b u n d a n c eo fp a t h o g e nb a c t e r i a斑节对虾单养P r a w n斑节对虾+海蜇+菲律宾蛤
19、仔P r a w n+J e l l y f i s h+C l a m斑节对虾+海蜇P r a w n+J e l l y f i s h非养殖对照C o n t r o l汉氏巴尔通体B a r t o n e l l ah e n s e l a e0.0 0 1 60.0 0 3 5琼氏不动杆菌A c i n e t o b a c t e rj u n i i0.0 0 1 9利沃夫氏不动杆菌A.l w o f f i i0.0 0 1 5短短芽孢杆菌B r e v i b a c i l l u s b r e v i s0.0 0 0 9缺陷短波单胞菌B r e v u n d
20、i m o n a sd i m i n u t a0.0 0 3 2浅绿气球菌A e r o c o c c u sv i r i d a n s0.0 0 0 40.0 0 0 4节瘤腐蹄杆菌D i c h e l o b a c t e rn o d o s u s0.0 0 0 7睾丸酮丛毛单胞菌C o m a m o n a s t e s t o s t e r o n i0.0 0 0 5大肠埃希氏菌E s c h e r i c h i ac o l i0.0 0 6 8食酸代尔夫特菌D e l f t i aa c i d o v o r a n s0.0 0 0 7韦氏钩端
21、螺旋体L e p t o s p i r aw e i l i i0.0 0 2 30.0 0 6 10.0 0 6 50.0 0 3 9产酸克雷伯氏菌K l e b s i e l l ao x y t o c a0.0 0 1 0图莱里弗朗西丝氏菌F r a n c i s e l l at u l a r e n s i s0.0 0 2 3不同军团菌L e g i o n e l l aa n i s a0.0 0 0 6偶发分支杆菌M y c o b a c t e r i u mf o r t u i t u m0.0 0 0 7成团泛菌P a n t o e aa g g l o
22、 m e r a n s0.0 0 0 8疮疱丙酸杆菌P r o p i o n i b a c t e r i u ma c n e s0.0 0 0 80.0 0 1 20.0 0 0 70.0 1 2 0变黄奈瑟氏球菌N e i s s e r i af l a v e s c e n s0.0 0 9 3铜绿假单胞菌P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a0.0 0 5 5副溶血弧菌V i b r i op a r a h a e m o l y t i c u s0.0 0 4 90.0 0 2 30.0 0 8 6皮氏罗尔斯通氏菌R.p i
23、c k e t t i i0.0 7 5 40.0 6 7 60.0 3 9 60.1 2 2 0红城红球菌R h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i s0.0 0 0 70.0 0 0 50.0 0 7 3表皮葡萄球菌S t a p h y l o c o c c u s e p i d e r m i d i s0.0 0 0 6沃氏葡萄球菌S.w a r n e r i0.0 0 2 2绿色糖单胞菌S a c c h a r o m o n o s p o r av i r i d i s0.0 0 2 10.0 0 1 3解藻酸弧菌V.a l
24、 g i n o l y t i c u s0.0 0 2 2总丰度T o t a l a b u n d a n c e0.0 9 4 00.1 0 5 70.0 5 5 10.1 5 8 3329第6期周 磊等:斑节对虾混养池塘微生物群落生态功能初探2.2 典型对虾混养池塘沉积物微生物群落氮循环功能分析不同对虾混养池塘沉积物中氮循环相关基因的总丰度见图1。斑节对虾单养和斑节对虾与海蜇和菲律宾蛤仔混养池塘中含有较高的氮循环相关基因,而斑节对虾与海蜇混养池塘中氮循环相关基因丰度与非养殖对照样品类似,这说明斑节对虾单养和斑节对虾与海蜇和菲律宾蛤仔混养模式具有较强的氮循环和利用能力。为了更好地理解
25、不同对虾养殖模式中氮循环路径的差异,分别计算氮循环各个过程关键酶基因的丰度,这些过程包括同化硝酸盐还原、异化硝酸盐还原、反硝化作用、氮固定、硝化作用、氮同化作用、氮矿化作用和氮摄取。各养殖模式沉积物中氮循环的不同过程基因的丰度见图2。由图2可见,异化硝酸盐还原、反硝化作用、氮同化作用、氮固定和硝酸盐摄取的相关基因在斑节对虾单养和斑节 图1 各样品中氮循环相关基因的总丰度F i g.1 T h e t o t a l a b u n d a n c eo fn i t r o g e nc y c l i n gg e n e si nd i f f e r e n t s a m p l e
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