UNC0379对胶质瘤细胞增殖影响的初步探索.pdf
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1、2023 年10 月 第 44 卷 第 5 期 首 都 医 科 大 学 学 报Journal of Capital Medical University Oct.2023Vol.44 No.5基金项目:国家自然科学基金项目(82170184),河南省医学科技攻关计划(联合共建)项目(LHGJ20220401)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(82170184),Medical Science and Technology Research Project of Henan Prov
2、ince(LHGJ20220401).Corresponding author,E-mail:liwencaipatho 网络出版时间:2023-10-20 1013 网络出版地址:https:/ 对胶质瘤细胞增殖影响的初步探索刘 秀 李文才(郑州大学第一附属医院病理科,郑州 450052)【摘要】目的 初步探索组蛋白甲基转移酶 KMT5A(lysine methyltransferase 5A)抑制剂 UNC0379 对胶质瘤细胞增殖的影响及作用机制。方法 用 UNC0379 处理胶质瘤细胞系 LN229,应用 CCK8 检测细胞的增殖情况,采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期情况;通过检测
3、不同浓度的 UNC0379 和替莫唑胺单独或联合用药时的细胞增殖情况,计算药物联用评分,评估 UNC0379对替莫唑胺治疗效果的影响。结果 UNC0379 能够有效抑制 LN229 细胞的增殖(P0.05),使 G2/M 期细胞比例增加,但并不引起 LN229 细胞的凋亡。另外,UNC0379 还可增强 LN229 细胞对替莫唑胺的敏感性。结论UNC0379 可能通过引起细胞周期阻滞抑制胶质瘤细胞增殖,并可增强替莫唑胺的治疗效果。【关键词】组蛋白甲基转移酶抑制剂;胶质瘤;细胞凋亡;细胞周期;替莫唑胺【中图分类号】R739.41 【文献标识码】APreliminary study on the
4、effect of UNC0379 on the proliferation of glioma cellsLiu Xiu,Li Wencai(Department of Pathology,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China)【Abstract】Objective To explore the effect and mechanism of UNC0379,an inhibitor of lysine methyltransferase 5A(KMT5A),on the pr
5、oliferation of glioma cells.Methods LN229 cells were treated with UNC0379,then cell proliferation was detected by Cell counting kit-8(CCK8),and cell apoptosis and cell cycle were measured by flow cytometry.Multi-drug combination response was also analyzed to evaluate the impact of UNC0379 on temozol
6、omide efficacy in glioma cells.Results UNC0379 inhibited the proliferation of LN229 cells effectively(P0.05).Although UNC0379 didnt induce apoptosis in LN229 cells,the percentage of G2/M cells increased.UNC0379 also promoted the efficacy of temozolomide in LN229 cells.ConclusionUNC0379 could inhibit
7、 the proliferation of glioma cells by inducing cell cycle arrest and could also enhance temozolomide efficacy.【Key words】histone methyltransferase inhibitor;glioma;cell apoptosis;cell cycle;temozolomide 胶质瘤是一类起源于神经胶质干细胞或前体细胞的颅内肿瘤,约占颅内所有原发肿瘤的 28%,占颅内所有原发恶性肿瘤的 80%1-2。其中,恶性度最高的胶质母细胞瘤占所有胶质瘤的一半以上,即使经过标准化
8、治疗其生存期也仅有 1415 个月2。目前,在以手术切除联合放射治疗和化学药物治疗(以下简称放化疗)作为标准治疗的同时,新的治疗药物和治疗策略也在不断试验中,以期突破胶质瘤的治疗瓶颈,其中参与表观遗传修饰的相关蛋白便是研究热点之一。脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)序列携带的信息不仅决定了亲代的表现性状,还可以将这些性状传递给下一代。此外,DNA 上的一些修饰虽然不改变 DNA 序列但是却能够影响生物体的性状,有时还能够传递给下一代,这种修饰被称为表观遗传修饰3-4。表观遗传修饰主要包括 DNA 甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白磷酸化等。这些修饰使 D
9、NA 的空间结构或者染色体的结构发生改变,进而导致基因的沉默或过度表达,对生物体性状产生影响5。组蛋白甲基转移酶 KMT5A 是人体内目前唯一已知催化组蛋白 H4 第 20 位赖氨酸单甲基化(H4K20me1)的酶。同时,KMT5A 还可以催化非组蛋白的甲基化,包括 p53 和增殖细胞核抗原(prolif-erating cell nuclear antigen,PCNA)6-7。本研究中使用的小分子化合物 UNC0379 是 KMT5A 的底物竞争性抑制剂。有研究8显示,UNC0379 在体外可抑制高危型神经母细胞瘤的生长,但是该抑制剂在胶质瘤领域首 都 医 科 大 学 学 报第 44 卷的
10、研究非常少。因此,本研究初步探讨了 UNC0379 对胶质瘤生长的影响及其潜在的作用机制。1 材料与方法1.1 实验材料DMEM 培养基、胎牛血清(Gibco 公司,美国);UNC0379(MCE 公司,美国);CCK8(Dojindo 公司,日本);Annexin V 结合缓冲液、Annexin V-FITC 抗体(Biolegend 公司,美国);碘化丙啶(propidium iodide,PI)、核糖核酸酶 A(Sigma-Aldrich 公司,美国);PI/RNAase 染液(BD 公司,美国);总蛋白提取试剂盒(Invent 公司,美国);H4K20me1 抗体(Abcam 公司,美
11、国);tubulin 抗体(Proteintech 公司,美国);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG 和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)。1.2 实验方法1)细胞增殖检测:在 96 孔板中接种细胞,每孔接种 LN229 细胞 3 000 个,放入培养箱中培养 24 h。取出 96 孔板,移去孔中的培养基,分别加入正常培养基或含 3.2 mol/L UNC0379 的培养基,将孔板放回培养箱中继续培养。在 24、48、72 h 后根据CCK8 使用说明检测细胞增殖情况,具体操作如下:从培养箱中取出孔板,移去待检测孔的培养基后再次加入 100 L 培养基和 10
12、 L CCK8,将孔板放回培养箱孵育 2 h 后酶标仪检测 450 nm 处的吸光值,计算细胞增殖水平。2)细胞凋亡检测:用含 3.2 mol/L UNC0379 的培养基处理 LN229 细胞,分别在 24、48、72 h 后进行流式凋亡检测。收集待检测细胞,先后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)和 Annexin V 结合缓冲液洗涤细胞。按照抗体推荐用量(每 1106个细胞加入 100 L Annexin V 结合缓冲液和 5 L An-nexin V-FITC 抗体),用 Annexin V-FITC 抗体重悬细胞后室温避光孵育 15 min;然
13、后加入 PI,使 PI 终浓度为 2 g/mL,继续室温避光孵育 15 min。洗涤细胞后,用 Annexin V 结合缓冲液重悬细胞并加入 4%(质量分数)多聚甲醛,使多聚甲醛终浓度为 1%。将细胞避光存放于 4 冰箱,固定过夜。洗涤细胞,然后用 50 g/mL 核糖核酸酶 A 重悬细胞,37 水浴中避光孵育 15 min。再次洗涤细胞,然后用适量 Annexin V 结合缓冲液重悬细胞,流式细胞仪检测。通过流式分析软件计算各样本凋亡细胞百分比。3)细 胞 周 期 检 测:用 正 常 培 养 基 或 含3.2 mol/L UNC0379 的培养基处理 LN229 细胞,分别在 24、48、7
14、2 h 后进行细胞周期检测。收集待检测细胞,预冷 70%(体积分数)乙醇重悬细胞并置于-20 冰箱固定 24 h。预冷 PBS 洗涤细胞,PI/RNAase 染液重悬细胞后室温避光染色 30 min,流式细胞仪检测。通过细胞周期分析软件计算各周期细胞比例。4)Western blotting 检测:用不同浓度(0、0.8、1.6、3.2 mol/L)的 UNC0379 处理 LN229 细胞,分别在 24、48、72 h 后按照总蛋白提取试剂盒使用说明提取蛋白,具体操作如下:移去培养皿中的培养基,用冷PBS 洗去残留的培养基,将培养皿置于冰上,加入细胞裂解液对细胞进行裂解,将细胞裂解液转移到预
15、冷的蛋白抽提离心柱中,4、16 000 g 离心 30 s,得到蛋白裂解液。通过二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法测定蛋白浓度,将等量蛋白质加入到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶5%(质量分数)浓缩胶和 15%(质量分数)分离胶 进行电泳分离后转至PVDF 膜上。用 5%(质量分数)脱脂奶粉室温封闭 1 h 后加入相应的一抗,4 摇床孵育过夜。TBST 洗涤3 次后加入相应的二抗,室温摇床孵育 1 h。孵育结束后,TBST 洗涤 3 次,用增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)显色系统于暗室中曝光。5)药物联用效应检测:参照 1)中
16、细胞增殖检测方法,分别用不同浓度的 UNC0379(0、0.2、0.4、0.8、1.6 mol/L)和替莫唑胺(0、25、50、100、200 mol/L)单独或联合处理 LN229 细胞,检测 450 nm 处的吸光值并计算细胞增殖水平。借助在线软件 SynergyFind-er(https:/synergyfinder.fimm.fi/)计算联用评分,若评分小于-10,表示两药为拮抗作用;若评分大于 10,表示两药为协同作用;若评分介于-10 到 10 之间,表示两药无相互作用。1.3 统计学方法 采用 SPSS 17.0 对数据进行分析,两组间均数比较采用 t 检验,以 P0.05 为差
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