基于高通量测序技术解析中高温制曲真菌群落的演替规律研究.pdf
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1、332023No.10(Tol.352)2023年第1 0 期(总第352 期)LIQUOR-MAKINGSCIENCE&TECHNOLOGY酿酒科技D0I:10.13746/j.njkj.2023203基于高通量测序技术解析中高温制曲真菌群落的演替规律研究杨勇,葛向阳1,2*,张聪芝,李燕荣,贾亚伟(1.江苏洋河酒厂股份有限公司,江苏宿迁2 2 38 0 0;2.宿迁学院,江苏宿迁2 2 38 0 0)摘要:以洋河中高温大曲为研究对象,通过高通量测序技术分析不同培养阶段真菌微生物群落结构及其演替规律,并探索了大曲发酵、生香等功能与真菌种类之间的潜在关系。研究结果表明,子囊菌门和毛霉门占据绝对
2、优势,子囊菌门包括半子囊菌纲的酵母目和散囊菌纲的散囊菌目,毛霉门即毛霉纲的毛霉目;属水平下,嗜热真菌属、根毛霉属、根霉属、曲霉属、生丝毕赤酵母属、横梗霉属、威克汉姆酵母属等真菌分别在不同培养阶段占据主导地位,前期主要是酵母属,后期主要是耐高温霉菌。其中,大曲发酵力与生丝毕赤酵母属相关性较高,酯化力与嗜热真菌属、红曲霉、威克汉姆酵母属相关性较高,水分则与孢圆酵母属的相关性较高。研究结果揭示了中高温大曲发酵过程中真菌群落的演替规律,解释了大曲发酵、生香等功能与真菌种类之间的潜在关系,有助于大曲微生物多样性形成机制的进一步解析,为优质大曲生产提供了理论依据。关键词:中高温大曲;高通量测序;真菌;演替
3、;相关性中图分类号:TS262.3;TS261.1文献标识码:A文章编号:1 0 0 1-92 8 6(2 0 2 3)1 0-0 0 33-0 6High-Throughput Sequencing Revealed Succession Law of FungiCommunity in Medium/High-Temperature DaquYANG Yong,GE Xiangyang2,ZHANG Congzhi,LI Yanrong and JIA Yawei(1.Yanghe Distillery Co.Ltd.,Suqian,Jiangsu 223800;2.Suqian Univ
4、ersity,Suqian,Jiangsu 223800,China)Abstract:Taking Yanghe medium/high-temperature Daqu as the research object,high-throughput sequencing technology was used toanalyze the structure and succession law of fungi communities at different cultivation stages.The potential relationship between Daqufermenta
5、tion,aroma production and fungal species was explored.The results showed that Ascomycota and Mucoromycota were domi-nant.At the genus level,Thermomyces,Rhizomucor,Rhizopus,Aspergillus,Hyphopichia,Lichtheimia,and Wickerhamomyces weredominant respectively at different cultivation stages.In the early s
6、tages,yeasts were dominant;in the later stages,high-temperature-re-sistant molds were dominant.The fermentation power of Daqu was highly correlated with Hyphopichia.The esterification power ofDaqu was highly correlated with Thermomyces,Monascus and Wickerhamomyces.The water content of Daqu was highl
7、y correlatedwith Torulaspora.The results revealed the succession law of fungi communities during the fermentation process of medium/high-tem-perature Daqu,explained the potential relationship between Daqu fermentation,aroma production and fungal species,contributed tofurther analysis of the formatio
8、n mechanism of microbial diversity of Daqu,and provided a theoretical basis for the production ofhigh-quality Daqu.Key words:medium/high-temperature Daqu;high-throughput sequencing;fungi;succession;correlation大曲作为一种富含多酶多菌的微生态制品,在中国白酒的酿造过程中起着糖化、生香、发酵、提供基金项目:2 0 2 1 年宿迁市科技计划(基础研究计划自然科学资金)项目(k202135)。作
9、者简介:杨勇(1 98 4-),男,江苏宿迁人,硕士,高级工程师,研究方向为微生物学与白酒酿酒工艺,E-mail:。通讯作者:葛向阳(1 97 4-),男,江苏新沂人,博士,正高级工程师,目前主要研究酿酒工程及生物工程,E-。342023 No.10(Tol.352)酿酒科技2023年第1 0 期(总第352 期)LIQUOR-MAKINGSCIENCE&TECHNOLOGY菌源的作用,是传统固态发酵蒸馏大曲酒的重要物质保障,被人们评价“曲为酒之骨。对大曲中真菌微生物的研究最早是通过传统的分离培养方法,葛向阳等2 经过多级富集、分离、纯化与鉴定,从洋河传统包包曲中分离得到毕赤酵母属、异常汉逊酵
10、母、假丝酵母等酵母菌类群以及卷枝毛霉、寄生曲霉、黑曲霉和黄曲霉等霉菌类群;罗惠波等3 发现泸州老窖大曲内存在大量的曲霉属、根毛霉属、横梗霉属等霉菌类群以及酿酒酵母、德巴利氏酵母属、异常威克汉姆酵母、锁掷酵母属等酵母菌类群。对中高温制曲发酵过程中可培养微生物的消长及生化指标的变化规律也做了相关研究(4-,然而,传统的分离培养方法受到培养基的选择性、微生物的生长特性等因素影响,很难直接展现大曲中微生物的真实群落结构。随着分子生物学的发展,基于免培养的高通量测序技术已经越来越广泛地应用于微生物群落的研究。谭崇尧等7 利用高通量测序发现北方派浓香型白酒大曲优势真菌有热子囊菌属、嗜热真菌属、威克汉姆酵母
11、属等,长江中游派优势真菌为曲霉属、热子囊菌属、嗜热真菌属,江淮派优势真菌有曲霉属、热子囊菌属、耐干霉菌属等,川派优势真菌有热子囊菌属、嗜热真菌属、曲霉属等;吴树坤等1 8 利用高通量测序发现四川不同地区浓香型白酒大曲中优势真菌为嗜热真菌属、曲霉属、嗜热子囊菌属、丝衣霉属、节担菌属;施思等9利用高通量测序技术发现浓香型白酒大曲在贮存过程中的真菌群落结构不断调整,毕赤酵母属、根霉属及横梗霉属成为最终的优势菌群;Lio对不同工艺的中、低温大曲的微生物群落变化进行研究,发现在不同环境作用下,微生物群落结构会发生改变。基于高通量测序技术,已经对细菌群落演替规律进行了相关分析叫。本文以中高温大曲为研究对象
12、,采用高通量测序技术对培菌发酵几个主要阶段的真菌群落进行分析,研究各阶段优势真菌的分布、丰度及其在培菌发酵过程中的演替规律,为进一步剖析制曲发酵机理提供可靠的微生物信息。1材料与方法1.1材料、试剂及仪器大曲样品:中高温大曲培养过程中入房(编号:RF,发酵0 天)、并房(编号:BF,发酵5天)、上架(编号:SJ,发酵9天)、大火(编号:DH,发酵1 5天)、下架(编号:XJ,发酵2 1 天)、出房(编号:CF,发酵35天)各个阶段的混合样,分别粉碎、混匀、装袋,于-8 0 保存备用。试剂耗材:TaKaRa Premix Taq?Version 2.0、E.Z.N.A.?Gel Extracti
13、on Kit(Omega,USA)、NEB-Next?Ultra TM II DNA Library Prep Kit for Illumi-na?(New England Biolabs,USA)。仪器设备:Novaseq6000PE250平台、美国Bio-Rad Laboratory S1000 型PCR仪、Thermo Nano-Drop One。1.2实验方法按照标准流程对大曲样品进行DNA提取,以ITS5-1737F和ITS2-2043R为引物进行PCR扩增,每个样本进行3个重复,并将同一样本的PCR产物进行混合,然后电泳检测、切胶纯化、建库测序。2结果与分析2.1测序有效性分析中高
14、温制曲各阶段真菌的richness曲线如图1所示。结果显示,随着测序深度的增加,各样本的richness指数曲线都是先增加后逐步趋于平缓,说明测序数据量足够大,可以反映中高温制曲各阶段样本中的绝大多数物种信息。80RFBF70-SJDH60-XJCFSJ50RF403020-BF10020406080100图1大曲培养各阶段真菌的richness曲线2.2Alpha多样性分析对中高温制曲各阶段的真菌群落进行Alpha多样性分析,结果见表1。所有样本的coverage均35杨勇,葛向阳,张聪芝贾亚伟基于高通量测序技术解析中高温制曲真菌群落的演替规律研究大于0.99,说明该结果能够真实反映真菌群落
15、结构。刚入房时,真菌丰度与菌群多样性都较低,说明自然接种的微生物种类与数量都较低;主发酵期,曲心温度升高,真菌大多不耐热,导致并房后真菌的丰度与菌群多样性都降至最低;此后进入潮火期,随着曲心温度进一步升高,能够适应高温的真菌种类在大曲中不断富集,因此上架时的真菌丰度与菌群多样性都开始升高;随着曲心温度保持60左右进入占火,嗜热真菌进一步增殖,曲皮水分也丧失殆尽,大火期的真菌丰度与菌群多样性进一步升至最高值;经过大火期的高温驯化与淘汰,下架时的真菌丰度与大火期相当,但菌群多样性降低;此后进入养曲期,曲心水分进一步降低,干燥缺水的环境逐渐不适合真菌的生长,因此出房时的真菌丰度基本不变,菌群多样性也
16、进一步降低。表1大曲培养各阶段真菌Alpha多样性指数样本序列数OTU数ChaolSimpsonAceCoverageRF29674749.00.2962.510.995BF577162023.10.8227.50.999SJ163855757.20.2464.320.999DH456227777.30.2082.020.999XJ857827676.20.3580.600.999CF750657878.30.4681.680.9992.3OTU分布Venn分析通过对中高温制曲各阶段的OTU进行统计分类,Venn分析结果如图2 所示。结果显示,真菌有11个OTUs是共有的;从入房到并房,真菌无
17、变化;上架时缓慢增加;进入大火期,真菌快速增加至最高点;下架时,真菌缓慢下降;出房时,真菌有所回升。2.4不同分类水平的物种变化通过合并相同物种分类的OTUs,从门、纲、目、科、属不同分类水平,统计平均含量前1 5的物种,其余的物种归于others中,根据百分比绘制真菌的分布柱状图,结果见图3与图4。从图3中可以看出,不同培养阶段大曲中的真菌都是以子囊菌门和毛霉门为主,两者占比超过90%以上,其中子囊菌门包括半子囊菌纲的酵母目和散囊菌纲的散囊菌目,毛霉门即毛霉纲的毛霉目。毛霉目前期很少,上架后才大量繁殖,丰度占SJXJ4611BFRF1310DHCF图2大曲培养各阶段真菌OTUs交叠Venn图
18、比高达42%,大火期间降至1 1%,下架后回升至32%,出房后又缓落至2 0%酵母目的丰度则先缓升后不断下降,入房时即高达8 8%,并房后升至99%以上,之后开始快速下降,上架、大火、下架时分别下降至52%、31%6%,出房时回升至8%;散囊菌目则先下降后上升,入房时占比1 0%,而后缓慢下降至3%,大火后迅速生长繁殖,丰度占比高达57%,而后维持较高水平,下架、出房时分别为53%、7 0%。从科水平看,以相对丰度1%为下限,共检测到1 2 个真菌科。入房时以酵母科、发菌科、曲霉科和法夫酵母科为主,占比分别为2 5%、2 2%、1 8%、16%,此外还有丰度不足5%的双足囊菌科、德巴列酵母科、
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