莱菔硫烷对D-半乳糖致衰老模型小鼠海马组织氧化应激水平的影响.pdf
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1、6期第 45 卷6 期2023 年 6 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University收稿日期:2023-03-09基金项目:宁夏留学回国人员创新创业项目(宁人社函 2021 352号);国家自然科学基金项目(82160617);宁夏自然科学基金项目(2022AAC05024)作者简介:赵家丽(1997),女,在读硕士研究生,研究方向:营养与疾病。通信作者:张瑞(1986),女,博士,副教授,研究方向:营养与疾病。E-mail:z_衰老是一个机制复杂的生物学现象和过程,机体中的抗氧化物随着年龄的增长而减少,导致其清除体内过多氧自由基的能力减弱,引发
2、衰老性损伤1-2。D-半乳糖可以减缓脑组织内自由基的清除,故而皮下注射 D-半乳糖是最经典且最接近自然衰老规律的衰老模型造模方式3-4。有研究5表明,氧化应激会引起神经元内 A茁 的沉积,当 A茁 沉积到一定程度就会对神经元产生损伤作用,引发进一步的氧化应激反应,造成更严重的伤害。丙二醛(malondialdehyde,MDA)和 4-羟基壬烯/4-羟基-2-壬烯(4-Hydroxynonenal,HNE)是公认的氧化应激标记物,并可促进与年龄相关的神经变性疾病的进展6-7。衰老会导致抗氧化酶类超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutat
3、hione peroxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase,CAT)等活性降低,从而减少 MDA 等氧化终产物的产生8-9。因此,保护氧化还原稳态可能可以有效防止或减缓衰老的发生。莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)是存在于西兰花等十字花科蔬菜中的亲电化合物,是细胞抗氧化反应的有效诱导剂,有助于维持细胞氧化还原稳态并减轻氧化应激10。有研究11表明,SFN 可通过上调 SOD 的表达增强机体对过氧化物的清除作用,降低组织过氧化损伤程度。SFN 还可通过激活核因子 E2 相关因子 2(nuclear factor-erythroid2-related factor 2
4、,Nrf2)/ARE 信号通路,增加Nrf2 和血红素氧合酶 1(heme oxygenase 1,HO-1)的表达,改善脑内的氧化应激状态,从而在放射性脑损伤、脑卒中、抑郁症等模型中发挥神经保护作用12-16。然而,SFN 是否在衰老小鼠海马组织中发挥抗氧化作用尚未可知。故本研究以 D-半乳糖诱导 C57BL/6 小鼠衰老模型,并给予 SFN 干预,通过检测小鼠海马组织酶活性和 Nrf2 转录与翻译水平的变化,进一步验证 SFN 在衰老模型海马组织中是否具有抗氧化作用。1材料与方法1.1主要试剂与仪器1.1.1主要试剂D-半乳糖(美国 Sigma 公司),莱菔硫烷对 D-半乳糖致衰老模型小鼠
5、海马组织氧化应激水平的影响赵家丽1,彭楠1,2,3,周宏桢1,高腾威1,2,3,罗少伟2,3,王一茜1,2,3,张瑞1,2,3(1.宁夏医科大学颅脑疾病重点实验室,银川750004;2.宁夏医科大学公共卫生学院,银川750004;3.宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室,银川750004)摘要:目的探讨莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)对衰老模型小鼠海马组织氧化应激水平的影响。方法将 24周龄健康小鼠按体质量随机分为对照组、模型组、干预组,每组 10 只,雌雄各半。模型组和干预组小鼠皮下注射 200 mg kg-1D-半乳糖,每日 1 次;干预组小鼠给予 25 mg kg-1SFN 灌
6、胃,每日 1 次,模型组小鼠灌胃等量蒸馏水;对照组小鼠皮下注射等量生理盐水,灌胃等量蒸馏水。干预至 48 周龄后,在末次给药 2 h 后取脑并称重。左侧海马组织用于检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和总抗氧化能力(T-AOC)活力,右侧海马组织用于检测 mRNA 与蛋白水平。结果与对照组相比,模型组小鼠海马组织 GSH-Px、CAT、T-AOC 活性、Nrf2 mRNA 水平均降低,MDA 含量升高(P均约0.05);与模型组相比,干预组小鼠海马组织 GSH-Px、SOD、CAT、T-AOC 活性、Nrf2 mRNA 和蛋白
7、水平均升高,MDA 含量降低(P均约0.05)。结论SFN 可增强衰老模型小鼠海马组织抗氧化酶类活性及抗氧化能力,减少其氧化损伤。关键词:莱菔硫烷;衰老;海马组织;抗氧化;核因子 E2 相关因子 2中图分类号:R151.4+1文献标识码:ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.06.007文章编号:1674-6309(2023)06-581-05论著581窑窑宁夏医科大学学报4缘卷SFN(加拿大 TRC 公司),Nrf2 抗体(美国SantaCruz Biotechnology 公司),二抗辣根过氧化物酶(北京中杉金桥生物技术有限公司),GSH-Px、SOD、C
8、AT 及 MDA 试剂盒(南京建成生物工程研究所),总 RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、RT PCR SYBR试剂盒 宝生物工程(大连)有限公司,核蛋白提取试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)。1.1.2主要仪器设备Real time PCR 仪(7500,美国 ABI 公司),光学显微镜(BX51,日本 Olym原pus 公司),石蜡切片机(RM2135,德国 Leica 公司),Multiskan MK3 酶标仪(美国 Thermo 公司),凝胶图像成像分析仪(美国 LICOR 公司),Image J图像分析软件(美国 NIH 公司)。1.2动物的饲养、分组、处理及样品采集24 周龄
9、C57BL/6 健康小鼠,由宁夏医科大学实验动物中心提供 动物证书编号:SCXK(宁)2015-0001。饲养环境温度(20依2)益,相对湿度40%耀70%,12/12 h 的光/暗循环,自由饮食。将小鼠按体质量随机分为对照组、模型组和干预组,每组 10 只,雌雄各半。模型组和干预组小鼠每日皮下注射 200 mg kg-1D-半乳糖 1 次;干预组小鼠给予 SFN 25 mg kg-1灌胃,每日 1 次,模型组小鼠给予等量蒸馏水灌胃;对照组灌胃等量蒸馏水,皮下注射等量生理盐水。以上操作持续处理至小鼠 48 周龄。在末次给药 2 h 后用异氟烷麻醉,取脑,称重。1.3方法与指标1.3.1酶学指标
10、测定分离小鼠海马,使用组织破碎仪制备 10%组织匀浆,12 000 r min-1,4 益离心 5 min,小心吸取上清液。按照试剂盒说明书步骤测定与计算海马组织 SOD、MDA、GSH-Px、CAT 和总抗氧化能力(T-AOC)活力。蛋白质浓度:取待测样品,加入考马斯亮蓝 G-250 溶液显色,充分混匀后,采用酶标仪在 595 nm 波长下比色,记录吸光值并在标准曲线上查找得到溶液蛋白质浓度。SOD:将上述海马组织匀浆稀释至 0.25%,加入底物于 37 益孵育 20 min,采用酶标仪在450 nm 波长下读数,并计算。MDA:采用 10%海马组织匀浆配制反应体系,95 益水浴 40 mi
11、n,3 500耀4 000 rmin-1离心 10 min。采用酶标仪在 532 nm 波长下读数,并计算。GSH-Px:制备0.25%海马组织匀浆,酶促反应后显色 15 min。采用酶标仪在 412 nm 波长下读数,并计算。CAT:采用 10%海马组织匀浆制备反应体系,采用酶标仪在 405 nm 波长下读数,并计算。T-AOC:采用 10%海马组织匀浆制备反应体系,室温反应6 min 后采用酶标仪在 520 nm 波长下读数,并计算。1.3.2Nrf2 mRNA 水平测定采用实时定量PCR 法测定总 mRNA 中 Nrf2 mRNA 水平。提取总 RNA 并统一稀释各样品的总 RNA,将
12、mRNA逆转录为 cDNA,以 Lamin A 为内参,再进行 PCR扩 增。Nrf2 引 物:5-AGCATGATGGACTTG 原GAGTTG-3 和 5-GCCATGAACCCCGTCTCAAT-3;Lamin A 引物:5-GGCTACAGACGCTGAAG原GAG-3 和 5-CTGTTCCACCTGGTCCTCAT-3。扩增体系:TB Green Premix Ex Tap 域12.5 滋L,上引物 1 滋L,下引物 1 滋L,灭菌水 9.5 滋L,cDNA1 滋L。反应条件:95 益预变性 30 s 后,95 益变性15 s、58 益复性 30 s、72 益延伸 30 s,循环指
13、数为 40。1.3.3Nrf2 蛋白水平测定用 Western blot 法检测 Nrf2 蛋白水平。提取小鼠右侧海马核蛋白并统一蛋白质浓度至 5 滋g 滋L原员。样品在沸水浴中煮沸 3耀5 min,离心,使蛋白变性。以 10%SDS-PAGE 电泳分离(100 V、30 mA、1.5 h),将分离胶中的蛋白质转移到转移电泳槽中的 PVDF 膜上(25 V、125 mA、1.5 h)。用含 5%脱脂奶粉的含吐温 20 的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液(tris-buffered saline with Tween 20,TBST),4 益封闭过夜。一抗 37 益孵育(兔抗 Nrf2,sc-1303
14、2,1颐200;小鼠抗 Lamin A,sc-71481,1颐200)2 h,二抗室温孵育 0.5 h 后增强化学发光(enhanced chemilu原minescence,ECL)显色并分析图像。1.4统计学方法采用 SPSS 24.0 统计学软件进行数据分析。计量资料用均数依标准差(x依s)表示,组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),两两比较采用LSD-t 法。P臆0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1脑质量三组小鼠脑质量差异无统计学意义(P跃0.05),见表 1。表 1三组小鼠脑质量比较(xs,mg)组别对照组模型组干预组n脑质量10331.8011.7510326.4017.
15、9110333.0015.382.2海马组织氧化应激指标测定结果由表 2 可知,与对照组相比,模型组小鼠海582窑窑6期表 2三组小鼠海马组织 GSH-Px、SOD、CAT、T-AOC 活性和 MDA 含量比较(xs)GSH-Px/(U mg-1)SOD/(U mg-1)CAT/(U mg-1)T-AOC/(U mg-1)MDA/(nmol mg-1)58.484.7745.913.1011.500.761.080.110.750.0550.434.32*43.364.379.570.97*0.870.10*1.040.07*58.326.34#46.352.5910.801.29#1.210
16、.10*#0.940.08*#组别n对照组10模型组10干预组10与对照组相比*P0.05;与模型组相比#P0.05。马组织 GSH-Px、CAT、T-AOC 活性均降低,MDA含量升高(P 均约0.05)。与模型组相比,干预组小鼠海马组织 GSH-Px、CAT、T-AOC 活性均增高,MDA 含量降低(P 均约0.05)。2.3Nrf2 mRNA 水平测定与对照组相比,模型组小鼠海马组织 Nrf2mRNA 水平下降(P约0.05);与模型组相比,干预组小鼠海马组织 Nrf2 mRNA 水平升高(P约0.05),见图 1。#1.51.00.50.0#P0.05。图 1三组小鼠 Nrf2 mRN
17、A 水平比较(n=10,xs)2.4Nrf2 蛋白水平测定与对照组相比,模型组小鼠海马组织 Nrf2蛋白水平差异无统计学意义(P跃0.05);与模型组相比,干预组小鼠海马组织 Nrf2 蛋白水平升高(P约0.05),见图 2。3讨论衰老是一个多层次、进程复杂、涉及多器官的过程。其中,脑衰老是一个复杂的过程,从亚细胞到器官层面都会受到影响。从形态学上看,严重的脑老化可表现为脑容量减少。在采用 D-半乳糖致亚急性衰老过程中,动物脑质量变化并不一致。饶娜等17对昆明种小鼠实施为期 8 周的D-半乳糖腹腔注射干预,剂量为每日 200 mg kg-1,小鼠脑质量减轻;而肖明良等18应用 100 mg k
18、g-1D-半乳糖皮下注射方式干预 2 月龄 ICR 小鼠,干预周期为 30 d,并未发现小鼠脑质量指数降低。本研究对 24 周龄 C57BL/6 小鼠每日进行200 mg kg-1皮下注射干预,连续干预 24 周,干预组小鼠脑质量与对照组相比差异无统计学意义,可能是因为不同研究使用的动物种属、给药剂量、给药时长等不同。GSH-Px、SOD、CAT 是生物体中的抗氧化酶家族的成员,其在清除体内多余氧自由基方面具有不可或缺的作用。而 MDA 是膜过氧化的终产物,其活性检测能反映机体内自由基的多少,进而推断自由基对机体损伤的程度。本研究中,衰老模型小鼠抗氧化酶类与 T-AOC 水平均降低,表明模型小
19、鼠已出现氧化损伤19。有研究14,20-21表明,SFN 在放射性脑损伤、创伤性脑病、帕金森病等模型动物中,可提高 SOD 等抗氧化酶类活性,减少 MDA 含量。本研究发现,SFN 干预可提高衰老模型小鼠海马组织抗氧化能力,减轻其氧化损伤程度,说明 SFN 可能通过抗氧化作用在衰老过程中发挥神经保护作用。Nrf2 是氧化还原反应中主要的转录因子,可调节氧化应激、线粒体自噬等功能相关基因的表#P0.05。图 2三组小鼠 Nrf2 蛋白水平比较(n=10,xs)#1.51.00.50.068 kDa37 kDaNrf2LAMIN A赵家丽,等.莱菔硫烷对D-半乳糖致衰老模型小鼠海马组织氧化应激水平
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