“朴实方”对慢传输型便秘小鼠结肠Cajal细胞及SCF_c-Kit信号通路的影响.pdf
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1、实 验 研 究692023 年总第 55 卷第 11 期慢传输型便秘(slow transit constipation,STC)是功能性便秘的一种,以结肠传输功能障碍,肠内容物通过缓慢为主要特点,主要症状为排便困难,并伴有排便频次降低、粪便干燥坚硬等表现1。本病全球发病率为14%,其中我国发病率为4.0%10.0%2-3。便秘会增加结直肠癌发病风险,诱发心脑血管疾病,常伴有焦虑、抑郁、睡眠障碍等,严重影响患者的生活质量4。现代研究发现,Cajal间质细胞(interstitial cells of cajal,ICC)在 胃 肠 道 动 力 障碍性疾病中具有重要作用5。ICC的特异受体酪氨酸
2、激酶受体(c-Kit)及其天然配体干细胞因子(stem cell factor,SCF)构成的信号途径对ICC的发生、发育及功能维持具有重要的调控作用6。朴实方为龙华医院曹永清教授治疗便秘的经验方,基于四君子汤化裁,加入枳实、厚朴、丹参等以活血行气、健脾益气,治疗便秘临床疗效显著7。本研究使用复方地芬诺酯建立STC小鼠模型,观察朴实方对STC模型小鼠SCF/c-Kit信号通路的影响,以挖掘朴实方治疗STC的作用机制,为临床用药提供科学依据。1 实验材料1.1 实验动物 SPF级8周龄ICR雄性小鼠50只,体质量(272)g,购自上海史莱克实验动物有限公司,许可证号:SCXK(沪)2017-00
3、05。饲养于上海中医药大学动物中心,饲养温度为16 22,相对湿度45%55%,自由饮水与进食,昼夜光照交替12h。本“朴实方”对慢传输型便秘小鼠结肠 Cajal 细胞及 SCF/c-Kit 信号通路的影响赵向东1 王贝贝1 李芳斓1 曹永清2 王可为3(1.广州中医药大学附属深圳市中医院,广东深圳 518000;2.上海中医药大学附属龙华医院,上海 230023;3.南京中医药大学附属南京中医院,江苏南京 210022)摘 要 目的:观察朴实方对慢传输型便秘(STC)模型小鼠结肠Cajal间质细胞(ICC)及干细胞因子(SCF)/酪氨酸激酶受体(c-Kit)信号通路的影响,探索朴实方治疗ST
4、C的作用机制。方法:50只ICR小鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组(普芦卡必利,每日灌胃给药量为0.3mg/kg)和朴实方高、低剂量组(每日灌胃给药量分别为17.0、8.5g/kg),每组10只。除正常组外,其余各组小鼠采用复方地芬诺酯混悬液连续灌胃2周构建STC模型。造模成功后各给药组每日分别予相应药物灌胃,正常组和模型组每日灌胃给予同体积生理盐水,各组均连续灌胃2周。干预完成后,使用活性炭灌胃法测定各组小鼠肠道推进率,苏木精-伊红(HE)染色比较各组小鼠结肠组织学特征,酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组小鼠血清SCF含量,蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测各组小鼠结肠组
5、织c-Kit蛋白、SCF蛋白表达情况,酶联实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组小鼠结肠组织c-Kit mRNA、SCF mRNA表达。结果:模型组小鼠肠道推进率明显低于正常组(P0.01),各给药组小鼠肠道推进率均明显高于模型组(P0.01)。模型组小鼠结肠肌层厚度降低,腺体数量减少且充血、水肿,各给药组小鼠结肠组织病理改变较模型组减轻,以朴实方高剂量组和阳性对照组改善更为显著。模型组小鼠血清SCF含量和结肠组织c-Kit mRNA、SCF mRNA及c-Kit、SCF蛋白相对表达量均明显低于正常组(P0.01);朴实方高、低剂量组及阳性对照组小鼠血清SCF含量明显高于模型
6、组(P0.01),结肠组织c-Kit mRNA、SCF mRNA及c-Kit、SCF蛋白相对表达量均明显高于模型组(P0.05,P0.01)。上述指标各给药组组间比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论:朴实方可以提高STC模型小鼠肠道推进率,改善小鼠结肠组织病理,其可能通过上调结肠组织中c-Kit和SCF的表达,激活SCF/c-Kit信号通路,促进结肠ICC增殖,增强肠道蠕动,从而改善STC模型小鼠便秘状态。关键词 功能性便秘;慢传输型便秘;朴实方;Cajal细胞;SCF/c-Kit信号通路基金项目 上海市进一步加快中医药事业发展三年行动计划项目ZY(2018-2020)-CCCX-100
7、7;深圳市科技计划项目(JCYJ20220531092203007);南京市中医药青年人才培养计划(ZYQ20042)doi:10.19844/ki.1672-397X.2023.11.020实 验 研 究702023 年总第 55 卷第 11 期实验经上海中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准编号:PZSHUTCM19030835)。1.2 实验药物 朴实方冻干粉:朴实方药物组成为党参20g、茯苓15g、白术20g、厚朴15g、枳实15g、丹参30g,饮片均购自上海中医药大学附属龙华医院中药房。中药饮片加入1100mL超纯水,完全浸泡30min,大火煮沸后转小火再煎煮30min,将药液倒出,
8、剩余药材重复上述步骤再次煎煮。2次水煎药液合并、过滤、蒸发浓缩、冷冻干燥,冻干粉置于-20环境中保存备用。实验开始前先配制成浓度为1.70g/mL(高剂量)的母液,再取部分母液用超纯水稀释成0.85g/mL(低剂量)浓度使用。复方地芬诺酯片(常州康普药业有限公司,批号1807013),研磨成粉,用蒸馏水配制成浓度1mg/mL的混悬液。琥珀酸普芦卡必利片(prucalopride,Janssen Cilag S.P.A公司,批号IEL0X00),研磨成粉,用蒸馏水配制成浓度0.03mg/mL的混悬液。1.3主要试剂活性炭(2018090716,广州鸿生炭业化工有限公司),阿拉伯树胶(201804
9、0506,合肥博美生物科技责任有限公司),SCF酶联免疫吸附(ELISA)法试剂盒(00502072019,上海司鼎生物科技有限公司),RNA逆转录试剂盒(FSQ-101,日本TOYOBO公司),BCA蛋白试剂盒(P0012S,碧云天生物技术有限公司)。1.4主要仪器荧光定量PCR分析仪(STEPONE,美 国ABI公 司),Mini pate spinner(MPS1000,美 国Labnet公司),稳压稳流电泳仪(DYY-6B,北京六一生物科技有限公司),高速冷冻离心机(450R,德国eppendorf公司),数显恒温水浴锅(HH-1,上海梅香仪器有限公司),台式低速冷冻离心机(L535R
10、,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司),荧光倒置显微镜(IX71,日本OLYMPUS公司),冻干机(Alpha2-4/LD plus,德国CHRIST公司),旋转蒸发仪(R220SE,上海巴玖实业有限公司)。2 实验方法2.1 分组与造模 50只ICR小鼠适应性饲养1周后随机分为正常组、模型组、阳性对照组和朴实方低、高剂量组,每组10只。除正常组外,其余各组小鼠予复方地芬诺酯混悬液灌胃造模,给药剂量为每日10mg/kg,1次/d,连续14d8。当小鼠出现进食减少、体质量减轻和大便粒型小、干硬等表现时,表明造模成功。正常组以等量生理盐水灌胃,1次/d,连续14d。此期间若出现小鼠死亡,则予补足,以确
11、保造模完成后各组鼠数均为10只。2.2给药 造模完成后,阳性对照组灌胃给予琥珀酸普芦卡必利混悬液0.3mg/(kgd),朴实方高、低剂量组分别灌胃给予相应中药溶液17.0、8.5g/(kgd),正常组、模型组每日灌胃给予同体积生理盐水,各组均每日灌胃1次,给药体积均为0.1mL/10g,连续14d。2.3取材末次给药结束后,各组小鼠禁食不禁水24h,管饲法灌胃0.2mL 5%活性炭,30min后眼眶采血,脱颈椎处死,取肠管进行肠道推进功能检测,完成后截取适当长度结肠,使用PBS溶液将结肠内的粪便清洗干净,截取3段长12cm的结肠组织,其中1段浸泡于10多聚甲醛中,2段放入冻存管并立即转移至-8
12、0冰箱冻存,以待后续检测使用。2.4 指标检测2.4.1 测定炭末推进率观察肠道推进功能 各组小鼠灌胃活性炭30min后,取包括胃和直肠末端在内的整个肠管,在肠道保持充分松弛情况下量取其肠道总长度及活性炭染色的肠管长度,计算炭末推进率(即为肠道推进率)。炭末推进率(%)=(炭末前沿至幽门的距离/肠道总长度)100%。2.4.2 苏木精-伊红(HE)染色法观察结肠组织学特征 取浸泡于10%多聚甲醛中固定的各组小鼠结肠组织,按照脱水、透明、浸蜡、包埋的顺序处理,切片、捞片、烤片,依次予二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇浸泡,自来水漂洗,苏木素、盐酸染色,自来水返蓝,1%伊红染色,最后使用95
13、%乙醇、无水乙醇脱水,二甲苯脱水透明,中性树胶封片,显微镜下观察并拍照。2.4.3 ELISA法检测血清SCF水平取各组小鼠血清,按ELISA试剂盒说明书上的方法检测小鼠血清中SCF含量。2.4.4 RT-PCR法检测结肠组织SCF、c-Kit mRNA表达 取冻存的各组小鼠结肠组织约100mg,采用Trizol法提取细胞总RNA,按照逆转录试剂盒说明书操作,将RNA反转录合成cDNA;然后进行实时定量PCR,严格按照SYBR试剂盒操作,反转录体系为20L,上下游引物各1.5L,cDNA使用2L,反应条件为首先95持续2min进行预变性,随后95持续5s,60持续10s,连续35 40个循环后
14、检测溶解曲线。反应结束后得到Ct值,采用2-Ct计算mRNA相对表达量。引物序列见表1。2.4.5 蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测结肠组织SCF、c-Kit蛋白表达 取冻存的各组小鼠结肠组织,快速研磨碾碎,收集蛋白样品,测定浓度;加实 验 研 究712023 年总第 55 卷第 11 期入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上清缓冲液进行电泳及转膜;转膜结束后,将PVDF膜室温封闭1h,PBST冲洗3次;二抗孵育,重复上述操作。采用化学发光检测系统,将PVDF膜加入化学发光底物,后将其置入增光屏的暗盒中曝光,扫描图片显影、定影。以GAPDH单抗检测作为内参对照,使用Image J软
15、件分析各组蛋白的表达。表1 c-Kit、SCF及内参引物序列引物序列产物长度/bpc-Kit上游引物:5-AACGATGTGGGCAAGAGTTC-3146下游引物:5-CCTCGACAACCTTCCATTGT-3SCF上游引物:5-ACGTGGACCAGTGGAAGAAC-3158下游引物:5-TTGCACATTCAGCATTCCTC-3GAPDH上游引物:5-TTGCACATTCAGCATTCCTC-3146下游引物:5-CCATTTGCAGTGGCAAAAG-32.5 统计学方法 使用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。本研究所有计量资料均符合正态分布,使用均值标准差(x-s)表
16、示。正常组和模型组比较采用两独立样本t检验;模型组与各给药组比较采用单因素方差分析。P0.05表示差异具有统计学意义。3 实验结果3.1各组小鼠肠道推进率比较模型组小鼠的肠道推进率明显低于正常组(P0.01),朴实方高、低剂量组及阳性对照组小鼠肠道推进率明显高于模型组(P0.01)。各给药组组间肠道推进率比较,差异无统计学意义(P0.05)。见表2。表2 各组小鼠肠道推进率比较(x-s)组别动物数/只肠道推进率/%正常组1058.224.64模型组1039.613.61*朴实方低剂量组1054.764.17#朴实方高剂量组1060.853.75#阳性对照组1055.482.87#注:与正常组比
17、较,*P0.01;与模型组比较,#P0.01。3.2 各组小鼠结肠组织学特征比较 正常组小鼠结肠黏膜表面光滑,可见大量腺体,无明显水肿充血;模型组小鼠结肠肌层厚度降低,腺体数量减少,出现明显充血、水肿;朴实方高剂量组及阳性对照组小鼠结肠组织肌层厚度较模型组明显增加,腺体数量增加,排列较整齐,充血水肿明显改善;朴实方低剂量组小鼠结肠黏膜组织病理改变仅轻度改善。见图1。正常组 模型组 阳性对照组 朴实方低剂量组 朴实方高剂量组图1 各组小鼠结肠组织病理表现(HE,200)3.3 各组小鼠血清SCF含量比较 模型组小鼠血清SCF含量显著低于正常组(P0.01);朴实方高、低剂量组和阳性药物组小鼠血清
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