转座酶可及性染色质测序法联合RNA测序探究解旋酶样转录因子基因的缺失对肝细胞癌的影响.pdf
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1、论 著7肝癌电子杂志2023 年 第 10 卷第 2 期转座酶可及性染色质测序法联合 RNA 测序探究解旋酶样转录因子基因的缺失对肝细胞癌的影响张艺旋,马亚锐,王小兵,焦宇辰*(国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院细胞生物学及分子生物学研究室,北京100021)摘要目的:探究解旋酶样转录因子(helicaseliketranscriptionfactor,HLTF)基因在肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)中潜在的调控机制。方法:构建 HLTF 基因稳定敲除的 HCC 细胞株。应用 RNA 测序法(RNAsequencing
2、,RNA-seq)检测并分析肝癌细胞 HLTF 基因敲除前后的差异表达基因。应用转座酶可及性染色质测序法(assayfortransposase-accessiblechromatinusingsequencing,ATAC-seq)检测 HLTF 基因敲除前后肝癌细胞染色质可及性的改变。采用 RNA-seq 和 ATAC-seq 多组学数据进行联合分析,寻找 HLTF 基因潜在的下游调控通路和关键基因。结果:癌症基因组图谱(thecancergenomeatlas,TCGA)数据库分析表明 HLTF基因在 HCC 组织中的表达水平升高,且其高表达与 HCC 预后不良有关联;RNA-seq分析
3、结果显示,与野生型肝癌细胞相比,HLTF 基因敲除细胞中有 563 个基因的表达水平上调,656 个基因的表达水平下调;ATAC-seq 分析结果显示,共 27818 个区域在 HLTF 基因缺失时染色质可及性发生显著改变,其中 14225 个区域染色质可及性增强,13593 个区域染色质可及性减弱;对染色质可及性改变的区域进行 motif 富集分析,数据显示在染色质可及性增强的区域,Atf3、Fra1 和 BATF 等被富集,在染色质可及性减弱的区域,Fra1、Fra2和JunB等被富集;RNA-seq和ATAC-seq多组学数据联合分析表明,重叠基因主要富集在花生四烯酸代谢通路、Wnt 信
4、号通路、钙离子信号通路和转化生长因子(transforminggrowthfactor,TGF-)信号通路等。HLTF 基因的缺失使核 RNA 输出因子 3(nuclearRNAexportfactor3,NXF3)基因表达水平升高。NXF3 基因高表达的 HCC患者的预后较 NXF3 基因低表达的 HCC 患者好。结论:在 HCC 中,HLTF 基因可能参与调控花生四烯酸代谢通路、Wnt 信号通路和 TGF-信号通路等,NXF3 基因可能是 HLTF 基因的潜在下游基因。关键词:转座酶可及性染色质测序法;RNA 测序法;肝细胞癌;解旋酶样转录因子Assay for transposase-a
5、ccessible chromatin using sequencing combined with RNA sequencing to explore the effect of helicase like transcription factor deletion on hepatocellular carcinomaZhang Yixuan,Ma Yarui,Wang Xiaobing,Jiao Yuchen*(Department of Cell Biology and Molecular Biology,National Cancer Center/National Clinical
6、 Research Center for Cancer/Cancer Hospital,Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Beijing 100021,China)AbstractObjective:To investigate the potential regulatory mechanism of helicase like transcription factor(HLTF)in hepatocellular carcinoma(HCC).Method:HLTF was knockou
7、t through clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9(Cas9)in HCC cell line.RNA sequencing(RNA-seq)was applied to detect and analyze the differentially 张艺旋国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院细胞生物学及分子生物学研究室基金项目:国家自然科学基金面上项目(82172988)*通信作者:焦宇辰,E-mail
8、:论 著8肝癌电子杂志2023 年 第 10 卷第 2 期肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,2020 年全球约有 90 万人确诊为肝癌。肝癌最常见的亚型是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)1,其死亡率居全球癌症死亡率第 3 位,5 年生存率仅 18%2。大多数 HCC患者确诊时已处于癌症晚期,无法采用手术切除术、肝移植术或局部经皮消融术等方式进行治疗3。解 旋 酶 样 转 录 因 子(helicase like transcription factor,HLTF)是 核 小 体 重 塑 复 合 物(Switch/sucrose nonfermentable,SWI/
9、SNF)家族的成员,含有一个 ATP酶结构域和一个 E3 泛素连接酶结构域4。这两个蛋白都含有一个 HIRAN(HIP116 and RAD5 N-terminal)结构域,该结构域专门与 3-OH 端单链 DNA 结合以维持基因组稳定性5-6。有研究在 40%的结直肠癌患者中观察到 HLTF 基因高度甲基化,同时这些患者肠道肿瘤的发生加速7,提示 HLTF 是一种肿瘤抑制因子。此外,在胃癌和宫颈癌患者中也存在 HLTF 基因高度甲基化8-10。然而两项关于 HLTF 基因的肝癌研究11-12显示,仅 6.3%和 9.8%的肝癌患者 HLTF 基因启动子甲基化。因此,HLTF 基因在 HCC
10、中的作用机制仍需要进一步研究。染色质可及性是指细胞核内大分子能够物理接触染色质化 DNA 的程度。绝大多数转录因子(transcription factor,TF)几乎只与开放染色质结合13。TF 能够对转录进行动态调控,并建立和维持一个持久的表观遗传环境。因此,染色质的可及性反映了 TF 结合和对一个基因位点的调控潜力。最近开发的转座酶可及性染色质测序法(assay for transposase-accessible chromatin using sequencing,ATAC-seq)可以对全基因组的染色质进行分析,将染色质可及性与转录组数据相结合,能够确定可能参与调控细胞内信号通路的
11、关键基因,有助于阐明疾病发生的分子调控机制。本研究利用 ATAC-seq 联合RNA 测序法(RNA sequencing,RNA-seq)初步探究HLTF 基因在 HCC 中可能的调控机制,旨在初步揭示其功能。1 材料与方法1.1 细胞和试剂 HepG2 肝癌细胞系,HEK-293T 细胞系(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心);DMEM 培养基,RPMI 1640 培养基,胎牛血清,青霉素-链霉素混合液,胰酶细胞消化液(0.25%)(北京细工生物科技有限公司);LentiCRISPR V2 载体 质 粒,psPAX2 质 粒,pMD2.G 质 粒(Addgene 公司);sgRNA
12、序列由北京擎科生物科技有限公司合成;Neofect DNA Transfection Reagent 转染试剂(零客创智生物科技有限公司);蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(MedChenExpress 公司);RIPA 蛋白裂解液(北京普利莱基因技术有限公司);PVDF 膜(Millipore 公司);NanoDrop 核酸定量仪(Thermo Fisher Scientific 公司);Tn5 转座酶(Vazyme Biotech 公司);Zymo DNA Clean&ConcentratorTM-5 试剂盒(Zymo Research 公司)。1.2 实验方法1.2.1 解旋酶样转录因子基因敲
13、除细胞系的构建 根据HLTF基因序列,设计得到3对sgRNA序列并合成(表1)。将LentiCRISPR V2载体线性化之后与sgRNA连接,将连接后的质粒转入DH5后扩增,测序鉴定无误后,使用去内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒后进行慢病毒的包装。表 1 sgRNA 序列序列名称碱基序列sgRNA1-F5-GTT GGA CTA CGC TAT TAC A-3sgRNA1-R5-TGT AAT AGC GTA GTC CAA CC-3sgRNA2-F5-GTC CAT TAC ATA GCA TAA GG-3sgRNA2-R5-CCT TAT GCT ATG TAA TGG AC-3sgRNA3
14、-F5-AAG GCA GAT GGA CTA AGC AA-3sgRNA3-R5-TTG CTT AGT CCA TCT GCC TT-3expressed genes of the wild type and HLTF knockout cells.Assay for transposase-accessible chromatin using sequencing(ATAC-seq)was applied to detect the changes in chromatin accessibility of the wild type and HLTF knockout cells.Th
15、e multi-omics analysis of RNA-seq and ATAC-seq was used to find the key signaling pathways and downstream genes of HLTF.Result:The cancer genome atlas(TCGA)database analysis showed that HLTF was highly expressed in HCC and was associated with poor prognosis;RNA-seq sequencing showed that 563 genes w
16、ere up-regulated and 656 genes were down-regulated in HLTF knockout cells compared to wild-type cells;ATAC-seq analysis showed a total of 27 818 regions had significantly altered in chromatin accessibility with HLTF deletion,including 14 225 regions with enhanced chromatin accessibility and 13 593 r
17、egions with weakened chromatin accessibility;motif enrichment analysis showed that Atf3,Fra1 and BATF were enriched in regions with enhanced chromatin accessibility,Fra1,Fra2 and JunB were enriched in regions with weakened chromatin accessibility;the combination of RNA-seq and ATAC-seq analysis show
18、ed that the overlapping genes were mainly enriched in the arachidonic acid metabolism pathway,Wnt signaling pathway,calcium signaling pathway and the transforming growth factor (TGF-)signaling pathway;the deletion of HLTF increased the expression of nuclear RNA export factor 3(NXF3)and highly-expres
19、sed NXF3 was associated with better prognosis in HCC patients.Conclusion:Our study pointed out that HLTF may be involved in regulating arachidonic acid metabolism pathway,Wnt signaling pathway,TGF-signaling pathway,etc.NXF3 may be a potential downstream gene of HLTF,and our study provided directions
20、 and ideas to elucidate the mechanism of HLTF in HCC.Key words:Assay for transposase-accessible chromatin using sequencing;RNA sequencing;Hepatocellular carcinoma;Helicase like transcription factor论 著9肝癌电子杂志2023 年 第 10 卷第 2 期将 HepG2 细胞铺在 6 孔板中培养,当细胞生长融合达到 70%80%时,取 500l 病毒加入细胞中,24h后换成完全培养基,48h 后每孔加入
21、含有 2g/ml 的嘌呤霉素培养基筛选阳性细胞,筛选 48h 后,将阳性细胞进行单克隆筛选,并测序验证。1.2.2 免疫印迹法 胰酶消化收集 HepG2-WT 和 HepG2-KO 细胞,用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的 RIPA蛋白裂解液裂解细胞,在 4条件下以 12 000r/min(r=8.5cm)离心 15min,分离上清液,使用 BCA 法行蛋白定量后进行 SDS-PAGE 蛋白电泳。然后将分离的蛋白质转移到 PVDF 膜上。用 5%的脱脂奶粉封闭1h,一抗 4孵育过夜。第 2 日用同种属的 HRP 结合的二抗室温孵育 2h,之后使用超敏发光液进行化学发光检测。本研究中使用的抗体为
22、:重组 Anti-HLTF 抗体(Abcam 公司,ab183042,1:1 000);GAPDH 兔多克隆抗体(Abclonal 公司,AC001,1:1 000);HRP 羊抗兔(H+L)(Abclonal 公司,AS014,1:1 000)。1.2.3 转座酶可及性染色质测序法分析 在 4下,将 HepG2-WT 和 HepG2-KO 细胞 500g 离心 10min 后收集 50 000 个细胞。用含 10mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、10mmol/L NaCl、3mmol/L MgCl2和 0.1%(V/V)Igepal CA-630 的缓冲液裂解细胞,使用 Tn5
23、 转座酶对细胞核进行标记,然后用 Zymo DNA Clean&ConcentratorTM-5试剂盒纯化被标记的 DNA。使用 NEBNextQ5Hot Start HiFi PCR Master Mix 扩增标记的 DNA 片段以制备文库。使用 Zymo DNA Clean&ConcentratorTM-5 试剂盒纯化文库。将文库整合在 Illumina Hiseq X Ten 上进行量化和测序。1.2.4 转座酶可及性染色质测序法数据处理 使用FastQC 软件评估测序质量。使用质控合格的序列进行下一步分析。使用 TrimGalore 软件去除接头和低质量序列。使用 Bowtie2 软件
24、将序列比对到 hg19 参考基因组上,并去除比对质量低的序列和比对到线粒体 DNA上的序列。使用 Picard 软件中的 MarkDuplicates 算法去除由于 PCR 产生的重复序列。使用 MACS2 寻找峰值。使用 DiffBind 识别差异性 ATAC-seq 峰,阈值设置为错误发现率(false discovery rate,FDR)0.05。使用ChIPseeker 对峰进行注释,基因转录起始点上游或下游3kb 内的区域被视为启动子。1.2.5 RNA 测序法分析 从样本中提取总 RNA,NanoDrop 测定 RNA 浓度。利用带有 oligo-dT 的磁珠从总 RNA 中分离
25、 mRNA,并将捕获的 mRNA 进行片段化处理。然后利用逆转录酶合成 cDNA 并对逆转录产物进行末端修复,然后在 3 末端加 A 碱基。随后,将该片段与测序接头相连接。连接产物经过纯化,去除连接不完整的产物及接头自连产物后,使用与接头序列互补的引物进行 PCR 扩增。最后用磁珠纯化得到测序文库。库检合格后,用 Illumina Novaseq 6000 测序平台对文库进行 PE150 测序。1.2.6 RNA 测序法数据处理 利用 FastQC(v0.11.9)软件对高通量测序平台的原始数据进行质量检测。使用fastp(v0.22.0)软件14对原始测序数据中可能出现的测序接头进行剪切去除
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