大豆GmCLC-d1_d2基因参与盐胁迫适应过程的生理功能.pdf
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1、 南京农业大学学报():/.:./.收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目()江苏省农业科技自主创新项目()作者简介:张露硕士研究生通信作者:於丙军教授博导主要从事植物逆境生理生态与分子遗传改良研究:.张露黄巧玥程聪等.大豆/基因参与盐胁迫适应过程的生理功能.南京农业大学学报():./.():.大豆/基因参与盐胁迫适应过程的生理功能张露黄巧玥程聪刘询於丙军(.南京农业大学生命科学学院植物逆境生物学实验室江苏 南京.新疆农业大学生命科学学院新疆 乌鲁木齐)摘要:目目的的 本文旨在研究大豆/基因及其启动子对盐胁迫的响应并探索其参与植物盐胁迫适应过程的生理机制 方方法法 从大豆品种中克隆了/基因分
2、别构建其植株 干扰()和过表达载体通过发根农杆菌介导转化获得 和过表达大豆发根组合植株利用根癌农杆菌介导转化获得过表达拟南芥分析和比较盐胁迫下植株的形态和生理指标变化 结结果果 与转空载大豆发根组合植株相比盐处理下/植株鲜重、叶片相对含水量()和叶绿素含量根和叶过氧化氢酶()、过氧化物酶()和超氧化物歧化酶()活性明显下降根、叶相对电解质渗漏率()和丙二醛()含量以及根、茎、叶 含量明显上升含量显著下降导致根、茎和叶特别是地上部/值显著上升而发根过表达大豆植株/的上述指标表现相反耐盐性有所增强盐胁迫下过表达/拟南芥种子发芽率、幼苗根长以及 周龄植株鲜重、叶片 及叶绿素含量等均明显优于野生型地上
3、部 和 含量显著降低、和 活性明显增强根和地上部 含量明显降低含量明显上升导致根和地上部特别是后者/值显著下降 结结论论/可通过增强盐胁迫下 在发根过表达大豆组合植株或过表达拟南芥化植株根部的吸收以及向地上部的转运和分配并在一定程度上抑制 的吸收和转运以维持植株特别是地上部较低的/值从而增强耐盐性其中 基因的效应更明显关键词:/基因大豆发根过表达过表达拟南芥/值耐盐性中图分类号:.文献标志码:文章编号:()/(.):/./()()/.()()()()/()()/././.()第 期张露等:大豆/基因参与盐胁迫适应过程的生理功能/././.:/盐胁迫是造成植物生长和发育受阻、作物产量和品质下降以
4、及威胁农业和食品安全的主要非生物逆境因子之一 由于盐渍化土壤中的盐分以 为主以、为主的离子毒害是植物盐害的主要形式之一其中 是造成盐害的主要阴离子 氯离子通道蛋白()是一类主要介导以 和 等阴离子的转运蛋白广泛定位于原核和真核生物的内膜系统 当植物遭受盐胁迫时 在参与植株体内阴离子吸收、转运和分配或稳态调控等方面发挥着重要作用 目前已陆续在拟南芥、烟草、水稻、马铃薯、玉米、波菜、柑橘、盐芥、大豆等多种植物中发现 基因 其中对拟南芥 基因家族 个成员()编码蛋白的功能研究较多如定位于液泡膜上的 主要作为/驱动 在液泡中的积累 与 相似性最接近两者在功能上可能有重复、和 都主要表现 转运活性 主要
5、负责叶肉细胞叶绿体基质中(由 还原而来)或 向叶绿体类囊体腔中运输大豆是我国主要农作物之一也是世界上种植最广泛的谷类豆科植物是人类重要的食用油、蛋白质和动物饲料的原料来源 栽培大豆()属于中度盐敏感植物相比较而言盐胁迫下栽培大豆对较 更敏感植株受伤害程度与其茎和叶或地上部 含量呈正相关 关于大豆 基因家族成员除 外还发现、和 等家族成员其中栽培大豆 和野生大豆 都可通过调控、等在植株根部的吸收及其向地上部(含茎和叶)的转运和分配以维持较低的/值和协调的阴离子稳态来增强转基因大豆和拟南芥植株的耐氯(盐)性 目前关于植物 家族中 同源基因功能的相关研究较少 等研究表明 可通过介导 或 等阴离子运输
6、来维持反式高尔基体()内 值的稳定 等发现 可负调控拟南芥幼苗的先天病菌免疫 突变体植株表现对致病菌丁香假单胞菌更强的抗性 本文主要研究了大豆/基因及其启动子对盐胁迫的响应模式并利用大豆发根和拟南芥转化技术探究其参与植物盐胁迫适应过程的生理机制旨在为今后利用该基因深入开展培育大豆或其他作物耐盐新种质材料提供理论依据 材料与方法.植物材料、菌株和质粒植物材料包括拟南芥(野生型)、本氏烟草()、栽培大豆(.)品种 菌株包括大肠杆菌、根癌农杆菌株 和发根农杆菌株 双元表达质粒包括 和.方法.基因结构和氨基酸序列特征分析 根据本实验室前期研究报道从大豆数据库 数据库(:/./)下载 (.)和(.)的基
7、因序列、序列和所编码蛋白的氨基酸序列 利用 在线工具(:/./.)分析 和 的基因结构 利用 .软件(:/./.)对 和 的氨基酸序列进行比对.大豆幼苗培养、提取和 大豆种子用 乙醇消毒后浸泡于去离子水中 后将种子转移至铺有湿润吸水纸的塑料盘中置于培养箱()暗中催芽 挑选发芽良好、一致的种子播种于含蛭石的塑料周转箱中用/营养液浇灌后放于植物生长室进行培养培养条件:昼、夜温度分南 京 农 业 大 学 学 报第 卷别为()和()光照强度 相对湿度 待第 三出复叶完全展开后将大豆幼苗分成 组一组继续用/营养液浇灌()另一组用含 的/营养液浇灌()分别于、取叶片(均为 组生物学重复)迅速用液氮冷冻后于
8、 保存备用 使用 提取试剂盒(上海生工)提取总 使用 型荧光定量 仪进行 检测 反应体系包含 ()引物 和 各.以大豆(.)为内参基因用 法计算相对表达量 引物如表 所示表 本研究中使用的引物 命名正向()反向()目的 .载体构建 选择 和 起始密码子 上游 的序列作为基因的启动子区设计引物分别克隆得到 和 的启动子片段插入 载体使其控制 基因表达即得到重组载体 和 基于 和 的 相似性很高选择二者完全相同的 序列作为 靶序列通过正向、反向分别插入 载体 内含子的上、下游获得重组 载体/分别克隆 和 的全长 序列插入 载体 启动子下游分别获得重组过表达载体 和 重组载体 、和 分别导入根癌农杆
9、菌 用于拟南芥遗传转化空载体()、基因沉默载体/和过表达载体、分别转化发根农杆菌 用于构建大豆发根组合植株 构建载体所用引物及序列见表.烟草叶片瞬时转化和 染色将含有重组载体 或 的根癌农杆菌 接种于含有 卡那霉素和 利福平的 液体培养基、振荡培养 待菌液 .时离心收集菌体后用含 乙酰丁香酮()的 溶液重悬然后于 黑暗静置 取生长 周的本氏烟草使用注射器将菌体重悬液注射到其叶片中注射后的烟草正常生长 后用 溶液处理正常培养的烟草作为对照()处理 后取叶片进行 染色最后用无水乙醇除去叶绿素观察着色深浅.大豆发根组合植株耐盐性分析 将已导入空载体或重组载体/、的发根农杆菌 接种于含 卡那霉素的 液
10、体培养基、振荡培养 待菌液.时离心收集菌体后用含 的 液体培养基(.)重悬室温静置 后根据 等的方法进行大豆发根转化和盐处理 主要步骤包括:在蛭石上培养 的大豆幼苗从子叶节下方 处剪下浸泡在已准备好的发根农杆菌重悬液中于室温黑暗静置过夜共培养 然后将转化受体转移到湿润的蛭石上继续培养待下胚轴伤口处出现愈伤组织并长出根时取出 第 期张露等:大豆/基因参与盐胁迫适应过程的生理功能幼苗剪去侧根移至/营养液中继续培养 周并取少量毛状根提取 进行 鉴定仅保留毛状根为基因 或过表达的大豆发根组合植株 转移至营养液继续培养 周后随机分成 组即正常营养液培养()和含 的营养液培养()处理 后拍照观察表型差异
11、根据 等的方法测定植株鲜重叶片相对含水量()和叶绿素含量根和叶相对电解质渗漏率()和丙二醛()含量以及抗氧化酶(、)活性 取新鲜根或叶(.)用 含 和.的 缓冲液(.)匀浆在 条件下 离心 取上清液即为粗酶液用于抗氧化酶活性测定 将正常培养和盐处理的大豆植株于烘箱中烘干至恒重后研磨成粉末根据 等的方法分别测定、含量.拟南芥遗传转化及耐盐性分析 利用根癌农杆菌介导的浸花法获得/过表达拟南芥收获的 代种子播种于营养土中喷洒 草铵膦溶液叶片不变黄能够正常生长的即为抗性植株 提取抗性植株叶片的 利用 检测确定基因过表达植株进一步收获 代纯合子种子并参照 等的方法进行耐盐性分析 分别取拟南芥、和 种子用
12、 乙醇消毒 在无菌超净台吹干后均匀播在 培养基、含 或 的 培养基上每天统计萌发率连续统计 此外将萌发一致的拟南芥移至 培养基、含 或 的 培养基上垂直培养 后统计根长 此外在营养土中培养约 周龄的拟南芥植株用 溶液处理 观察表型差异并拍照后测定植株鲜重、叶片、叶绿素含量、和 含量、抗氧化酶(、)活性以及根和地上部、含量.数据分析以上各试验均重复 次 应用 .软件对试验数据进行均值、标准差、差异显著性分析 结果与分析./基因及其编码蛋白氨基酸序列特征根据 数据库中、的基因序列和 序列进行分析显示 基因全长 基因全长 但两者均含有 个内含子(个外显子)且 序列均为 (图)通过对所编码蛋白的氨基酸
13、序列比对发现:和 氨基酸序列一致性高达.仅有 处氨基酸不同均含有 蛋白家族典型的 个保守的跨膜结构域和 个()结构域都具有()、()和()等氨基酸残基保守区其中相应关键氨基酸残基位点如保守区()表明它们对阴离子如 较 可能具有优先选择属性保守区()(“门控”谷氨酸)和保守区()(“质子”谷氨酸)是 蛋白家族中/的关键谷氨酸可表明它们的转运蛋白属性(图)./基因及启动子对盐胁迫的响应模式 结果显示正常培养()的大豆幼苗叶片 和 基因的表达维持在相对稳定的水平但在 处理 过程中两者的表达水平均显著上调上调倍数分别达.和.倍(图)分别将 和 基因的启动子片段克隆到 载体的()基因上游得到重组载体 和
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