大豆根腐病生防链霉菌IRHB47的鉴定、生物学特性及防治效果.pdf
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1、第 41 卷 第 5 期2023 年 10 月四川农业大学学报Journal of Sichuan Agricultural UniversityVol.41 No.5Oct.2023大豆根腐病生防链霉菌IRHB47的鉴定、生物学特性及防治效果曾钰涵,赵心宇,胡玉,魏登琴,尚静,常小丽*(四川农业大学农学院/四川省玉米大豆带状复合种植工程技术中心,成都 611130)摘要:【目的】明确1株大豆根际细菌IRHB 47的分类地位及对根腐病的生防潜力,为根腐病防治提供理论依据。【方法】采用平板对峙培养、菌悬液浸种、盆栽接种试验检测IRHB47的抑菌效果、安全性、根腐病防效及环境适应性,通过菌落形态特
2、征及16S rDNA序列分析鉴定其分类地位。【结果】菌株IRHB 47对尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum、腐皮镰孢菌F.solani、藤仓镰孢菌F.fujikuroi等5种大豆根腐病致病菌的菌丝生长抑制率达51.04%70.40%;对大豆白绢病菌Selerotium rolfsii、草莓灰霉病菌Botrytis cinerea、水稻稻瘟病菌Pyricularia oryzae等9种病原真菌拮抗作用显著。盆栽试验发现,IRHB 47菌悬液浸种预防处理和苗期灌根治疗处理均能够显著降低尖孢镰孢菌引起的大豆根腐病病情指数和植株死亡率。经16S rDNA序列分析,IRHB 47被鉴定为弗吉
3、尼亚链霉菌Streptomyces virginiae,为革兰氏阳性菌。生物学特性检测表明,该菌株可在pH 510、6.25%LB培养基上生长,具有良好的耐酸碱性和低营养胁迫能力,且能够产生蛋白酶和酪蛋白酶以诱导大豆抗性。【结论】弗吉尼亚链霉菌IRHB 47菌株抑菌谱广,环境适应性强,能够有效缓解根腐病症状。关键词:链霉菌;大豆根腐病;尖孢镰孢菌;防治效果中图分类号:S435 文献标志码:A 文章编号:1000-2650(2023)05-0801-10Identification,Biological Characteristics and Control Efficacy of Strept
4、omyces virginiae IRHB47 Against Soybean Root RotZENG Yuhan,ZHAO Xinyu,HU Yu,WEI Dengqin,SHANG Jing,CHANG Xiaoli*(College of Agronomy,Sichuan Agricultural University,Sichuan Engineering Research Center for Crop Strip Intercropping System,Chengdu 611130,China)Abstract:【Objective】This study aims to unc
5、over the fungal growth inhibition and control efficacy of the strain IRHB 47 from soybean rhizosphere on soybean root rot,and provide some references for the control of root rot.【Method】Plate dual culture method,seed soaking wit bacterial suspension,and pot experiments were used for detecting the my
6、celial inhibition effects,application safety,disease control efficiency and environmental tolerance.Morphologial characteristics of colony combined with phylogenetic analysis based on 16S rDNA sequence were used for clarifying its taxonomy.【Result】The strain IRHB 47 had the fungal growth inhibition
7、effects on five Fusarium species causing soybean root rot including F.oxysporum,F.graminearum,F.asiaticum,F.solani and F.fujikuroi with the inhibition rate of 51.04%-70.40%.And meanwhile it also displayed good antagonistism against nine agricultural pathogenic fungi like Botrytis cinerea,Selerotium
8、rolfsii,Pyricularia oryzae.Pot experiment array showed that IRHB 47 application through either seed soaking or irrigation at the seedling growth significantly decreased the disease index of soybean root rot caused by F.oxysporum and promoted its survival of soybean seedlings.doi:10.16036/j.issn.1000
9、-2650.202306244收稿日期:2023-06-28基金项目:四川省自然科学基金(2022NSFSC0173);四川省育种攻关项目(2021YFYZ0018);四川省重点研发计划项目(23ZDYF3037)。作者简介:曾钰涵,本科生,E-mail:。*责任作者:常小丽,博士,副教授,主要从事土传病害发生规律及防控研究,E-mail:xl_。四川农业大学学报第 41 卷 Analysis of 16S rDNA sequence showed that IRHB 47 was identified as Streptomyces virginiae and was gram positi
10、ve bacteria.Furthermore,this strain not only had strong stress tolerance under low nutrients(6.25%LB)and wide pH condition(pH 5-10)but also produced Protease and Caseinase to induce plant immunity.【Conclusion】This study indicates that Streptomyces virginiae IRHB 47 has big potential to be explored a
11、s one biocontrol bacterium of soybean root rot because of wide fungal growth inhibition effects and strong stress tolerance.Keywords:soybean root rot;Streptomyces;F.oxysporum;biocontrol efficiency大豆根腐病(soybean root rot)是由多种病原菌独立或复合侵染,进而引起大豆根部和茎部腐烂的世界性土传病害,严重影响大豆的产量和品质1-3。国内外已报道的大豆根腐病菌主要包括镰孢菌Fusarium
12、 sp.、腐霉菌Pythium sp.、疫霉菌Phytophthora sp.和丝核菌 Rhizoctonia solani3-5。我国各大豆产区,因生境、栽培方式、大豆品种等差异,引起根腐病的病原菌种类不同,其中以尖镰孢菌F.oxysporum和腐皮镰孢菌F.solani为优势病原菌6。目前生产上大豆根腐病的防治主要采取土壤处理、种子包衣和药剂拌种7-9等多种防治方法,但化学药剂使用不当常带来农药残留、土壤污染、病原菌抗药性等问题。生物防治因其环境友好、无残留、低风险等优点,已成为农业可持续发展的重要技术,是植物病害绿色防控的发展趋势,应用前景广阔10。国内关于大豆根腐病的生物防治有许多报道
13、,目前研究较多、应用较广泛的是木霉菌 Trichoderma11、芽孢杆菌Bacillus12、假单胞杆菌Pseudomonas13和链霉菌 Streptomyces14等。邵红涛等11筛选获得3株木霉菌能够显著降低土壤中病原尖孢镰孢菌的种群丰度,且对大豆幼苗具有促生作用。郭荣君等12发现芽孢杆菌菌株B006和B010对大豆根腐病菌F.oxysporum和F.solani具有拮抗。链霉菌属Streptomyces是放线菌门Actinobacteria中最大最高等的一个类群,其环境适应性强,是植物根际最常见的微生物之一14。链霉菌具有多种功能,有些能够产生抗生素与植物生长激素类物质,促进植物生长
14、,提高植物对于生物与非生物逆境的抵御能力,如酸性疮痂链霉菌Streptomyces acidiscabies15;有些能够产生次生代谢物质、胞外水解酶,抑制多种病原菌的蛋白质和核苷酸合成,裂解病原真菌细胞壁,从而阻碍病原真菌生长16-17。由于链霉菌代谢物对病原菌特异性较强,对人畜无毒害作用,对环境无残留、无污染等优势,近年来在土传病害生物防治研究中引起广泛关注,已被报道用于防治黄瓜枯萎病17、水稻白叶枯病18和香蕉枯萎病19等。弗吉尼亚链霉菌Streptomyces virginiae是一种土壤习居菌,多来源于森林土壤或植物根际,能够产生多种次生代谢物、活性物质,特别是产生抗生物维吉尼亚霉素
15、virginiamycin,在农业生产中常用作动物饲料添加剂,以促进牲畜生长和防止细菌感染,也能够有效降解水体或土壤中的甾体化合物污染20-21,但关于该链霉菌在植物病害防治中的研究尚未见报道。本研究基于课题组前期从四川带状套作大豆根际分离获得的一株具有生防潜力的细菌菌株IRHB 47,拟进一步明确其抑菌活性、根腐病防效、分类地位、生物学特性及环境适应性,以期为大豆根腐病防治提供理论依据。1材料和方法1.1试验材料供试材料:大豆根际细菌菌株IRHB 47分离自四川农业大学雅安教学农场的玉米大豆带状套作田,栽培方式为周年玉米与大豆轮作,根腐病发生率为 5%20%;试验所用 14 种常见农作物病原
16、菌(包括5种大豆根腐病常见致病菌)的详细信息见表1,均由四川农业大学农学院植物病理学实验室提供。供试大豆:南豆12,前期鉴定为镰孢菌根腐病中感品种5,用于安全性和盆栽防效试验。培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基:马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉 15 g、水 1 000 mL;胰蛋白胨大豆琼脂培养基(tryptose soya agar,1/2 TSA):胰蛋白胨7.5 g、大豆胨2.5 g、氯化钠2.5 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL;蛋白酶测定培养基:脱脂奶粉1.2 g、琼脂1.0 g,水100 mL;肉膏蛋白胨(Luria
17、-Bertani,LB)培养基:胰蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g;营养琼脂(nutrient agar,NA)培养基:牛肉浸膏3 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、琼脂20 g、酵母膏1 g、水1 000 mL;酪蛋白琼脂培养基:牛 肉 浸 粉 0.3 g、酪 蛋 白 1.0 g、NaCl 0.5 g、802第 5 期曾钰涵,等:大豆根腐病生防链霉菌IRHB47的鉴定、生物学特性及防治效果NaH2PO4 0.2 g、溴百里酚蓝 0.005 g、琼脂 1.5 g、水100 mL;几丁质酶活性培养基:(NH4)2SO4 0.2 g、MgSO4 0.05 g、KH2PO4 0.1
18、g、NaCl 0.05 g、胶体几丁质3.0 g、刚果红0.02 g、琼脂1.5 g、水100 mL;纤维素酶鉴定培养基:KH2PO4 0.1 g、酵母浸粉0.5 g、蛋白胨1.0 g、NaCl 1.0 g、CMC-Na 1.0 g、MgSO4 0.02 g、刚果红0.02 g、琼脂1.5 g、水100 mL;固氮作用测定培养基:KH2PO4 0.2 g、MgSO4 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaCO5.0 g、甘露醇10.0 g、CaSO4 0.1 g、琼脂15.0 g;解磷作用测定培养基:葡萄糖10.0 g、(NH4)2SO4 0.5 g、NaCl 0.3 g、MgSO4 0.3
19、g、MnSO4 0.03 g、K2SO4 0.3 g、FeSO4 0.03 g、Ca3(PO4)2 5.0 g、琼脂15.0 g;高粱粒培养基:将高粱粒煮至七成熟后滤水、取适量放入150 mL锥形瓶中(总体积的1/3),用封口膜和牛皮纸封口;以上培养基均在121,高压灭菌30 min后使用。1.2试验方法1.2.1IRHB47菌株的拮抗能力测定采用平板对峙法测定IRHB 47对5种大豆根腐病常见病原菌及9种常见植物病原菌的菌丝生长的拮抗作用。各待测病原菌在PDA平板上活化培养35 d,打菌饼(直径5 mm)并接种于含有1/2 TSA固体培养基的平板中心。将LB液体培养基中活化培养的IRHB47
20、菌液,在距平板中心点左右各4 cm处平行划线,于28 下黑暗培养37 d。以在1/2 TSA培养基平板上仅接种各病原菌作为空白对照。各处理3个重复,试验独立重复3次。待空白对照组各病原菌菌丝长满平板时,测量病原真菌直径,并参照下列公式计算相对抑制率。相对抑制率/%=(对照菌落直径-处理菌落直径)(对照菌落直径-菌饼直径)1001.2.2IRHB47对大豆幼苗的安全性测定选取健康、大小一致的南豆12种子,依次用30%H2O2溶液处理10 min,无菌水冲洗3次,灭菌滤纸擦净种子表面残留水分,然后种脐朝下摆放装有灭菌蛭石的磁盘中,其上覆盖2 cm厚的灭菌蛭石,待保湿催芽。用接种环挑取LB斜面上保存
21、的IRHB47菌落,置于150 mL LB液体培养基150 r/min振荡培养24 h;随后5 000 r/min离心10 min,弃上清,收集菌体;最后,用50120 mL PBS缓冲液冲洗菌体,获得OD600值为0.3、0.5、0.8和1.0的IRHB47菌悬液,待用。设置OD600值为0.3、0.5、0.30.8、0.8和1.0共5个处理,以PBS缓冲液浸种为对照(CK),分别以不同OD600的菌悬液连续3 d浇灌在灭菌蛭石中催芽的大豆种子,其中,OD600=0.30.8处理采用菌悬液梯度浇灌处理,即为第1天OD600=0.3,第2天OD600=0.5,第3天OD600=0.8。每个处理
22、30粒种子,每天各处理浇灌菌悬液30 mL。各处理于28、16 h光/8 h暗条件下培养3 d,观察大豆出芽及健康情况,参照下列公式计算各处理发芽率。发芽率/%=(种子总数量-未发芽种子数量)种子总数量 100取上述各处理出芽状况一致的种子,移栽入装有营养土的花盆(直径230 mm,高210 mm)中,每盆2株,每处理20株,随机浇灌各处理对应浓度菌悬液,每株10 mL。盆栽苗置于28、16 h光/8 h暗的条件下培养14 d后,移出幼苗洗净根部,吸干水分,表1本研究的14种常见农作物病害病原菌Table 1Pathogenic fungi of 14 agricultural crops u
23、sed in this study病原菌Pathogenic fungi尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum禾谷镰孢菌Fusarium graminearum亚洲镰孢菌Fusarium asiaticum腐皮镰孢菌Fusarium solani藤仓镰孢菌Fusarium fujikuroi凸脐蠕孢菌Exserohilum turcicum平脐蠕孢菌Bipolaris maydis胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides交链格孢菌Alternaria alternate灰梨孢菌Pyriclaria oryzae立枯丝核菌Rhizoctonia solani
24、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea齐整小核菌Selerotium rolfsii链格孢Alternaria alternate菌株编号Strain codeB3S1A1s4A3s1A4s6A4s1YRDB_1Bm_05GJ3GB0_2_1Po_2S1RS_07St07XHT007YX20寄主Host大豆大豆大豆大豆大豆玉米玉米柑橘柑橘水稻玉米草莓大豆烟草所致病害Disease大豆根腐病大豆根腐病大豆根腐病大豆根腐病大豆根腐病玉米大斑病玉米小斑病柑橘炭疽病柑橘褐斑病水稻稻瘟病玉米纹枯病草莓灰霉病大豆白绢病烟草赤星病803四川农业大学学报第 41 卷 测量各处理大豆幼苗生长指标(株高、茎粗
25、、叶面积、地上干重、地下干重),明确各菌悬液处理对大豆幼苗生长的影响。1.2.3IRHB 47菌悬液对大豆根腐病的盆栽防效测定参照Chang X.等6方法稍作修改,将120 g高粱粒煮熟后装入 250 mL 的三角瓶,高压蒸汽灭菌 2次,待用。将尖孢镰孢在28 下于PDA培养基上培养5 d,取6个菌饼接种到灭菌高粱粒培养基中,于28 暗培养710 d,待高粱粒表面长满菌丝体。将带菌高粱粒转置25 烘箱中烘干12 h,后经粉碎机制成粉末扩繁体。取1 g粉末扩繁体接入9 mL无菌水,于28、150 r/min条件下振荡30 min,逐级梯度稀释至10-4。吸取100 L悬液涂布于PDA平板,计算不
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