延龄草总皂苷通过调控GRP...PSCI大鼠海马神经元损伤_王刚.pdf
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1、中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023,39(2):241-249杂志网址:http:/延龄草总皂苷通过调控GRP78/IRE1/TRAF2/JNK信号通路抑制内质网应激而减轻PSCI大鼠海马神经元损伤*王刚,杨丽君,杨丹,段壬泽,赵方毓,陈显兵(湖北民族大学附属民大医院病理科,湖北民族大学医学部,湖北 恩施 445000)摘要 目的:探讨延龄草总皂苷(TST)对卒中后认知障碍(PSCI)大鼠海马神经元的保护作用及分子机制。方法:将采用改良Zea Longa线栓法造模成功的大鼠随机分为模型(model)组、TST(100 mg/kg)组
2、和盐酸多奈哌齐(DON;0.45 mg/kg)组,另设假手术(sham)组,每组10只,连续给药4周。采用Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力;TTC染色检测大鼠脑梗死体积变化,HE、Nissl和TUNEL染色观察大鼠海马组织神经元病理变化;免疫组化及 Western blot 检测葡萄糖调节蛋白 78(GRP78)、肌醇需求酶 1(IRE1)、肿瘤坏死因子受体相关因子 2(TRAF2)、磷酸化 c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、胱天蛋白酶 12(caspase-12)、Bax和 Bcl-2的蛋白水平。结果:与sham组相比,model组大鼠逃避潜伏期显著延长,穿越平台次数及目标象限
3、停留时间显著减少(P0.01);大鼠脑梗死体积显著增大,神经元尼氏小体数量显著减少,凋亡细胞显著增多;海马组织中GRP78、IRE1、TRAF2、p-JNK、caspase-12和Bax蛋白水平显著升高,Bcl-2蛋白水平显著降低(P0.01)。与model组比较,TST组及DON组大鼠逃避潜伏期显著缩短,穿越平台次数及目标象限停留时间显著增加(P0.01);大鼠脑梗死体积显著缩小,神经元尼氏小体数量显著增多,凋亡细胞显著减少;GRP78、IRE1、TRAF2、p-JNK、caspase-12和Bax蛋白水平显著降低,Bcl-2蛋白水平显著升高(P0.01)。结论:TST对PSCI大鼠海马神经
4、元具有保护作用,其机制可能与减轻内质网应激、减少神经元凋亡并抑制GRP78/IRE1/TRAF2/JNK信号通路有关。关键词 延龄草总皂苷;卒中后认知障碍;内质网应激;细胞凋亡;GRP78/IRE1/TRAF2/JNK信号通路中图分类号 R74;R363.2 文献标志码 A doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.006Total saponins from Trillium tschonoskii Maxim attenuate hippocampal neuronal injury in PSCI rats by inhibiting endoplasmi
5、c reticulum stress via regulating GRP78/IRE1/TRAF2/JNK signaling pathwayWANG Gang,YANG Lijun,YANG Dan,DUAN Renze,ZHAO Fangyu,CHEN Xianbing(Department of Pathology,Minda Hospital of Hubei Minzu University,Medical Department of Hubei Minzu University,Enshi 445000,China.E-mail:)ABSTRACT AIM:To investig
6、ate the protective effect of total saponins from Trillium tschonoskii Maxim(TST)on hippocampal neurons in rats with post-stroke cognitive impairment(PSCI),and to explore the molecular mechanism.METHODS:The rat PSCI model was successfully established by the modified Zea Longa suture method,and the ra
7、ts were randomly divided into model group,TST(100 mg/kg)group,and donepezil hydrochloride(DON;0.45 mg/kg)group.Another normal rats served as sham group.There were 10 animals in each group,and they were given continuous administration for 4 weeks.Morris water maze was used to detect the learning and
8、memory ability of rats,TTC staining was used to detect the volume change of cerebral infarction in rats,and HE,Nissl and TUNEL staining was used to observe the pathological changes of neurons in the hippocampus of rats.The protein levels of glucose-regulated protein 78(GRP78),文章编号 1000-4718(2023)02-
9、0241-09 收稿日期 2022-09-30 修回日期 2022-12-16*基金项目 国家自然科学基金资助项目(No.82260821);湖北民族大学博士启动基金项目(No.MD2020B014)通讯作者 Tel:13517134626;E-mail:241inositol-requiring enzyme 1(IRE1),tumor necrosis factor receptor-associated factor 2(TRAF2),phosphorylated c-Jun N-terminal kinase(p-JNK),caspase-12,Bax and Bcl-2 were d
10、etected by immunohistochemistry and Western blot.RESULTS:Compared with sham group,the escape latency of the rats in model group was significantly prolonged,and the number of platform crossings and the residence time in the target quadrant were significantly decreased(P0.01).The volume of cerebral in
11、farction in rats was significantly increased,the number of neuronal Nissl bodies was significantly decreased,and the number of apoptotic cells was significantly increased.The protein levels of GRP78,IRE1,TRAF2,p-JNK,caspase-12 and Bax in the hippocampus were significantly increased,and the expressio
12、n of Bcl-2 was significantly decreased(P0.01).Compared with model group,the escape latency of the rats in TST group and DON group was significantly shortened,and the times of crossing the platform and the residence time of the target quadrant were significantly increased(P0.01).The cerebral infarcti
13、on volume of the rats was significantly reduced,and the number of neuronal Nissl bodies was significantly increased.Apoptotic cells were significantly reduced.The protein levels of GRP78,IRE1,TRAF2,p-JNK,caspase-12 and Bax were significantly decreased,and the protein expression of Bcl-2 was signific
14、antly increased(P0.01).CONCLUSION:TST has a protective effect on hippocampal neurons in PSCI rats,and its mechanism may be related to reducing endoplasmic reticulum stress and neuronal apoptosis and inhibiting GRP78/IRE1/TRAF2/JNK signaling pathway.KEY WORDS total saponins from Trillium tschonoskii
15、Maxim;post-stroke cognitive impairment;endoplasmic reticulum stress;apoptosis;GRP78/IRE1/TRAF2/JNK signaling pathway卒中后认知障碍(post-stroke cognitive impairment,PSCI)是指由卒中引起的从轻度认知障碍到痴呆的一系列综合征,是世界范围内卒中后发病率和死亡率的主要来源。PSCI包括两种不同程度的认知损害,即卒中后认知障碍非痴呆(post-stroke cognitive impairment with no dementia,PSCIND)和卒中
16、后痴呆(post-stroke dementia,PSD)。研究表明,19.3%的卒中患者在中风后 10 年内发展为痴呆症1。因此,针对PSCI早期干预治疗,阻止PSCI向PSD发展,是亟待解决的问题。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是指细胞受到各种应激因素的影响,使内质网腔内出现错误折叠和未折叠蛋白质积聚、Ca2+平衡紊乱,引起细胞内稳态失衡的状态2-3。而未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)是指 ER 应激发生时,细胞为促进蛋白质正确折叠,或降解错误折叠蛋白质而产生的应激反应4。PSCI的发病机制复杂,有
17、缺血再灌注损伤、氧化应激、炎症反应、自噬等机制5-6。研究显示,ERS在PSCI发展过程中起重要作用,适当的ERS有利于去除错误折叠的蛋白质,对疾病的病理过程起到保护作用7。但是,在严重或长期内质网应激的病理条件下,内质网的生物学功能受损,引发海马神经元凋亡,从而导致认知功能下降8-9。目前,能够引起细胞凋亡的信号转导途径共有三种:死亡受体信号途径、线粒体途径以及内质网应激途径10-11。而在内质网应激介导的凋亡途径中,JNK和caspase-12的激活起着重要作用12-13。延龄草(Trillium tschonoskii Maxim,TTM)又名头顶一颗珠,为湖北省恩施地区珍贵的土家药材,
18、该药味甘、性平,有小毒。前期研究发现,其提取物TTM总皂苷(total saponins from TTM,TST)具有抗氧化、延缓衰老和神经保护作用,但其作用效果和分子机制仍有待深入研究14-15。因此,本项工作采用改良线栓法行大脑中动脉栓塞术制备PSCI大鼠模型,进一步探讨其对 PSCI大鼠学习记忆能力及海马神经元的保护机制。材料和方法1实验动物SPF级雄性SD大鼠60只,2月龄,体质量(20020)g,由三峡大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(鄂)2017-0012。动物饲养在本校清洁级动物房,温度控制在 2325,相对湿度控制在 50%60%,常规适应性喂养1周后开始实验。2药品
19、、试剂与仪器头顶一颗珠采自恩施本地,经专家鉴定为百合科延龄草属植物延龄草的干燥根茎。洁净药材后,经烘干粉碎置于圆底烧瓶内,加入适量75%乙醇浸泡萃取。将提取后的药液过滤并浓缩干燥,得延龄草提取物,加入双蒸水将提取物完全溶解,采用饱和正丁醇再次萃取,减压浓缩干燥,检测提取物中总皂苷含量为14.72 mg/g生药。盐酸多奈哌齐(donepezil hydrochloride,DON)片(批号:0000001782,浙江华海药业股份有限公司)。TTC 染液(批号:G3005,Solarbio);TUNEL 凋亡试剂盒(批号:E-CK-A321,武汉伊莱瑞特生物科技股242份有限公司);免疫组化试剂盒
20、(批号:2201269710A,福州迈新生物技术开发有限公司);葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)抗体、肌醇需求酶 1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG和HRP标记的山羊抗小鼠 IgG(批号分别为 ab21685、ab37073、ab6721 和ab6789;Abcam);肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2,TRAF2)、磷酸化 c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated
21、 c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)和胱天蛋白酶 12(caspase-12)抗 体(批 号 分 别 为:ML02846、WL01813、WL03268,万类生物技术有限公司);Bcl-2和Bax抗体(批号分别为 A19693和 A19684,ABclonal);-actin 抗体(批号:66009-1-Ig,武汉三鹰生物技术有限公司)。1510型酶标仪(Thermo Scientific);水迷宫系统(Top Scan 2.00);Western Blot电泳及转膜全套装置(Bio-Rad)。3主要方法3.1大脑中动脉闭塞(middle cerebral arter
22、y occlusion,MCAO)大鼠模型的制备60只SD大鼠随机分为造模组(50只)和假手术(sham)组(10只)。造模组参照文献 16 采用改良 Zea Longa 线栓法制备MCAO大鼠模型;sham组仅切开皮肤,钝性分离肌肉及筋膜,分离出左侧颈总动脉后即缝合切口。手术后将动物置于放有清洁垫料的饲养盒内并维持大鼠体温,待大鼠苏醒后进行行为学评分,13分为造模成功。其中造模组50只大鼠术后共死亡13只,sham组无死亡,剩余存活造模组大鼠进行神经功能评分,纳入评分标准的造模大鼠一共30只。3.2MCAO 模型的评价与动物的分组干预按照Zea Longa 5分法对造模后1、3、7、14和2
23、8 d大鼠神经功能进行评分,并将30只造模成功大鼠随机分为模型(model)组(10 只)、TST 组(10 只)和 DON 组(10只),连同上述sham组(10只)大鼠进行实验。根据动物与人体间等效剂量确定各组大鼠的给药量,TST组给予 100 mg/kg TST 进行灌胃,DON 组给予 0.45 mg/kg DON进行灌胃,sham及model组给予等体积的双蒸水灌胃,各组均连续灌胃28 d。3.3Morris水迷宫评价大鼠学习记忆能力给药结束当天对大鼠进行定位航行实验,共持续5 d,提前将实验大鼠搬进水迷宫实验室以适应新环境,系统自动将圆形水面分为4个象限,求生平台放在第3象限略低于
24、水面0.61.0 cm处,大鼠面向池壁分别沿第1、2、4象限放入,系统自动记录60 s内大鼠寻找平台所需时间,即逃避潜伏期;第6天休息;第7天上午进行正式定位航行实验,将大鼠沿第1象限放入求得寻找平台所需时间,下午进行空间探索实验,将平台撤去,大鼠沿第1象限放入,记录60 s内大鼠穿越平台次数及目标象限停留时间比,并进行统计分析。3.4脑组织灌注及海马病理形态学观察给药7 d后每组随机挑选出 3只大鼠进行 TTC染色,以 10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠,将大脑完整剥取出后,20 冰箱冷冻20 min,沿冠状位切1 mm厚片,加入适量TTC染液覆盖脑组织,放入37 恒温箱中20
25、min,期间注意翻面,拍照分析;给药28 d后每组取3只大鼠进行灌注固定,大鼠麻醉后,经心脏灌注固定,断头取全脑,沿大脑视交叉处做45 mm冠状切片,将其置于4%多聚甲醛中固定48 h。常规脱水、石蜡包埋后,行4 m石蜡切片,进行HE、Nissl和 TUNEL 染色,切片扫描并观察脑组织形态改变情况。3.5免疫组化测定 GRP78、IRE1、TRAF2、p-JNK和caspase-12蛋白在海马CA1区的表达定位脑组织被制成3 m石蜡切片后,置于75 摊片机中烘烤2 h,二甲苯脱蜡 3 次,每次 10 min,无水乙醇浸泡 3次,每次 5 min,纯水冲洗 2 min,置于柠檬酸钠配成的修复液
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