非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓...刺激雏鸡脾脏的转录组学分析_吴绿怡.pdf
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1、54卷南 方 农 业 学 报 774非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫刺激雏鸡脾脏的转录组学分析吴绿怡,刘思勤,廖艳鹏,任超*(天津农学院动物科学与动物医学学院/天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室,天津300384)摘要:【目的】探究非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(NRTUAs)感染雏鸡脾脏的转录组学变化,明确NRTUAs对雏鸡脾脏先天性免疫的调节效果,为研发家禽抗弓形虫疫苗提供理论依据。【方法】分别以NRTUAs和磷酸盐缓冲液(PBS)感染14日龄雏鸡,感染后第3 d采集脾脏组织样品进行转录组测序,筛选出NRTUAs组与PBS组间的差异表达基因(DEGs),然后进行GO功能注释、KEGG信号
2、通路富集及蛋白调控网络分析,并通过实时荧光定量PCR验证转录组测序的准确性。【结果】与PBS组相比,从感染NRTUAs的雏鸡脾脏中筛选出499个DEGs(286个为上调DEGs,213个为下调DEGs),且NRTUAs组中上调表达的DEGs多于下调表达的DEGs。GO功能注释分析发现,DEGs注释在生物过程(Biological process,BP)、细胞组分(Cellular component,CC)和分子功能(Molecular function,MF)三大类别的58个功能条目上,主要涉及端粒蛋白定位建立正调控、蛋白稳定、含伴侣蛋白T复合物、内质网腔、内质网、内质网膜组成部分、纺锤中央
3、区及未折叠蛋白结合等功能条目;KEGG信号通路富集分析显示,DEGs主要富集在内质网蛋白加工通路、RNA转运、细胞周期、钙信号通路、黏着斑、细胞衰老、神经活性配体受体相互作用、细胞因子细胞因子受体相互作用通路及氨基酸生物合成等通路中;蛋白互作网络分析结果表明,DEGs编码蛋白PLK1、CCNB1、CDK1、CDC20、CCNA2和NDC1均在细胞周期通路上调表达。实时荧光定量PCR验证结果显示,只有2个DEGs(CXCL12和VPREB3)呈上调表达,其余8个DEGs呈下调表达,与转录组测序结果基本一致。【结论】感染NRTUAs后雏鸡脾脏免疫相关基因表达上调,且多数DEGs富集在内质网蛋白合成
4、与细胞周期等相关信号通路上,脾脏细胞活动明显增强,即通过加快建立细胞连接及启动先天性免疫反应而积极对抗弓形虫入侵。关键词:非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫;雏鸡;转录组学;脾脏;免疫中图分类号:S852.729文献标志码:A文章编号:2095-1191(2023)03-0774-10收稿日期:2023-01-11基金项目:国家自然科学基金项目(31902277)通讯作者:任超(1986-),https:/orcid.org/0000-0002-1994-6876,博士,主要从事兽医免疫学与寄生虫学研究工作,E-mail:第一作者:吴绿怡(1998-),https:/orcid.org/0009-
5、0005-6113-2490,研究方向为禽寄生虫病学与家禽免疫学,E-mail:南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023,54(3):774-783ISSN 2095-1191;CODEN NNXAABhttp:/DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.03.013Transcriptome analysis of chick spleens stimulated bynonreplicating Toxoplasma uracil auxotrophsWU L-yi,LIU Si-qin,LIAO Yan-peng,REN
6、 Chao*(College ofAnimal Science and Veterinary Medicine,TianjinAgricultural University/Tianjin Key Laboratory ofAgricul-turalAnimal Breeding and Healthy Husbandry,Tianjin 300384,China)Abstract:【Objective】The purpose of the study was to explore the transcriptomic changes of chick spleens infectedby n
7、onreplicating Toxoplasma uracil auxotrophs(NRTUAs),to clarify the regulatory effect of NRTUAs on the innate im-munity in chick spleens,so as to provide theoretical basis for the development of anti-Toxoplasma gondii vaccine in poul-try.【Method】14-day-old chickens were infected with NRTUAs and phosph
8、ate buffer saline(PBS)respectively.3 d afterinfection,spleen tissue samples were collected for transcriptome sequencing,and differentially expressed genes(DEGs)between NRTUAs and PBS groups were screened.Then GO functional annotation,KEGG signaling pathway enrichmentand protein regulatory network an
9、alysis were performed.The accuracy of transcriptome sequencing was verified by real-time fluorescence quantitative PCR.【Result】Compared with PBS group,there were 499 DEGs(286 were up-regulatedDEGs and 213 were down-regulated DEGs)screened from the chick spleens infected with NRTUAs,and the NRTUAsgro
10、up had more up-regulated DEGs than down-regulated DEGs.GO functional annotation analysis found that DEGs was3期7750引言【研究意义】弓形虫病是常见的人畜共患寄生虫病。自1939年首次报道鸡感染弓形虫以来,在全球范围内陆续发现大规模感染鸡群的病例(Dubey,2010)。鸡作为弓形虫重要的中间宿主,在一些人类感染率较高的地区常作为哨兵动物用于土壤弓形虫包囊监测,尤其是长期在户外活动的散养鸡群习惯从地面啄食,极易接触并感染弓形虫,而存在通过食物链感染人类的风险(Dubey et al.,
11、1998;Fernandes etal.,2016;柳立新等,2022)。至今,除了可防止绵羊流产的疫苗Toxovax外,尚未研发出能有效预防人类及家禽感染弓形虫的疫苗(Innes et al.,2019)。非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(NonreplicatingToxoplasmauracil auxotrophs,NRTUAs)即同时敲除乳清酸核苷-5-单磷酸脱羧酶基因(Orotidine-5-monophosphate decarboxylase,ompdc)和尿嘧啶核苷磷酸化酶基因(Uridine phosphorylase,up),可有效阻断弓形虫嘧啶合成与补救途径。NRTUAs
12、在缺失尿嘧啶的细胞中无法增殖,且在小鼠体内会被快速清除,是一种较安全的疫苗株(Fox and Bzik,2002)。因此,探讨NATUAs对鸡的免疫调节效果,可为禽用抗弓形虫疫苗的开发及临床应用提供理论依据。【前人研究进展】NRTUAs在哺乳动物体内无法增殖,但可入侵哺乳动物细胞并形成纳虫泡(Fox et al.,2013,2017)。作为一种潜在的免疫调节剂,NRTUAs已丧失毒力,无致病性,即使在不产生IFN-或缺乏T细胞、B细胞和NK细胞的免疫缺陷动物中也能安全耐受,不会造成肝功能损伤(Fox and Bzik,2010;Bairdet al.,2013a)。单次低剂量接种NRTUAs可
13、迅速产生一种CD8+T细胞依赖的终生保护性免疫,对抗弓形虫的再次入侵(Gigley et al.,2009)。弓形虫优先入侵髓样细胞,如树突状细胞和单核/巨噬细胞,接种NRTUAs后同样可观察到髓样细胞的优先靶向性,且被NRTUAs入侵的髓样细胞表现为免疫激活状态。小鼠在接种NRTUAs后通过抗原递呈细胞刺激保护性的CD8+T细胞依赖性免疫和体液免疫,提高宿主免疫力,从而发挥NRTUAs抗弓形虫感染的作用(Sanders et al.,2015)。此外,NRTUAs可能是一种可用于癌症治疗的安全疫苗。接种NRTUAs后,卵巢癌小鼠、黑色素瘤小鼠和胰腺癌小鼠的血清IL-12p40和IL-12p7
14、0均显著增加(Baird et al.,2013b)。NRTUAs治疗IL-12p40或IL-12p35基因敲除小鼠时则失去抗肿瘤作用,表明NRTUAs激活髓样细胞产生IL-12是抗肿瘤反应的关键(Bahwal et al.,2022)。综上所述,NRTUAs是潜在的优秀抗弓形虫疫苗株。【本研究切入点】至今,有关弓形虫感染小鼠、猪、猫等哺乳动物的转录组学研究已有较多报道(Cong et al.,2018;He et al.,2019;Warunek et al.,2021;Wang etal.,2022a),但弓形虫感染家禽的转录组学研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过转录组测序技术分析NR
15、TUAs感染对雏鸡脾脏转录组学的影响,挖掘重要信号通路及差异表达基因(Differentially expressedgenes,DEGs),明确NRTUAs对雏鸡先天性免疫的调节效果,为研发家禽抗弓形虫疫苗提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料1日龄罗曼蛋鸡购自天津市进华养殖场,健康状况良好。预试验检测蛋鸡各器官的荷虫量以确定是否感染弓形虫,计算结果显示各处理组鸡只脾脏荷虫量均为零,即未感染过弓形虫,可进行后续试验(任超等,2021)。NRTUAs虫株和Vero细胞均由中国农业大学国家动物原虫实验室保存并提供。annotated on 58 functional items in thre
16、e major categories of biological process(BP),cellular component(CC)and mo-lecular function(MF).They mainly involved functional entries of positive regulation of establishment of protein localiza-tion to telomere,protein stabilization,chaperonin-containing T-complex,endoplasmic reticulum lumen,endopl
17、asmicreticulum,integral component of endoplasmic reticulum membrane,spindle midzone and unfolded protein binding.KEGGsignaling pathway enrichment analysis showed that DEGs were mainly enriched in endoplasmic reticulum protein proces-sing pathway in endoplasmic reticulum,RNA transport,cell cycle,calc
18、ium signaling pathway,focal adhesion,cellularsenescence,neuroactive ligand-receptor interaction,cytokine-cytokine receptor interaction pathway and amino acidbiosynthesis pathways.The results of protein interaction network analysis showed that the expression of DEGs codingproteins PLK1,CCNB1,CDK1,CDC
19、20,CCNA2 and NDC1 were up-regulated in the cell cycle pathway.Real-timefluorescence quantitative PCR verification results showed that 2 DEGs(CXCL12 and VPREB3)were up-regulated,andthe other 8 DEGs were down-regulated,which basically conformed with the transcriptome sequencing results.【Conclu-sion】Th
20、e expression of immune-related genes is up-regulated in chick spleens infected with NRTUAs,and most of DEGsare enriched in the related signaling pathways of endoplasmic reticulum protein synthesis and cell cycle.The activity ofspleen cells is greatly enhanced,which is to accelerate the establishment
21、 of cell connections and initiate the innate im-mune response to actively fight against the invasion of T.gondii.Key words:nonreplicating Toxoplasma uracil auxotrophs;chick;transcriptomics;spleen;immunityFoundation items:National Natural Science Foundation of China(31902277)吴绿怡等:非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫刺激雏鸡脾
22、脏的转录组学分析54卷南 方 农 业 学 报 7761.2NRTUAs培养与收集通过在Vero细胞中连续传代以维持NRTUAs的速殖子。Vero细胞接种至添加2%胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基中,置于37、5%CO2恒温培养箱中培养,每隔24 h更换1次培养基。采用5 mL注射器数次抽取培养液使培养物分离,再用1 mL注射器小心破碎Vero细胞,使弓形虫速殖子释放至胞外,以5 m孔聚碳酸酯膜过滤去除Vero细胞,即获得纯化的速殖子(张晓,2018)。1.3NRTUAs感染雏鸡将1日龄雏鸡随机分为2组(NRTUAs组和PBS组),每组3羽,每组单独饲养,雏鸡可自由饮水进食;饲养至14日龄
23、,鸡只状态良好,平均体重13510 g。NRTUAs组每只雏鸡颈部皮下注射0.2 mL的弓形虫速殖子悬液(5106个/mL),PBS组于颈部皮下注射等量的磷酸盐缓冲液(PBS)。每日监测雏鸡的临床症状,在感染后第3 d对各组雏鸡进行称重及剖检。1.4雏鸡脾脏组织转录组测序感染后第3 d采集NRTUAs组和PBS组雏鸡的脾脏,每组采集3份脾脏样品,且确保脾脏样品合格(不降解),干冰低温保存送至北京百迈客生物科技有限公司,通过Illumina NovaSeq 6000平台完成转录组测序,包括样品检测、cDNA文库构建、质检及上机测序。1.5雏鸡脾脏转录组序列组装及DEGs筛选脾脏组织总RNA为输入
24、材料,质检合格后构建cDNA文库,基于边合成边测序(Sequencing by syn-thesis,SBS)获得的原始数据首先需要确保Reads质量,通过去除含有接头、低质量的Reads获得高质量的Clean reads,以保证后续分析的准确性。使用HI-SAT2(v2.0.4)分别将各样品的Clean reads与指定参考基因组进行序列比对,评估转录组文库质量,再根据比对结果通过ASprofile进行可变剪接预测、基因结构优化分析及新基因发掘,最后根据基因在不同样品中的表达差异筛选出DEGs。1.6DEGs的GO功能注释、KEGG信号通路富集及蛋白调控网络分析通过BLAST和KOBAS 2
25、.0分别对筛选获得的DEGs进行GO功能注释分析及KEGG信号通路富集分析,同时以HMMER在Pfam数据库中进行氨基酸序列比对分析,获得DEGs编码蛋白的注释信息。以FPKM为衡量转录本或基因表达水平指标计算基因表达量,采用Heatmap进行聚类分析,再以DEGseq2(v1.6.3)分析有生物学重复的DEGs样本。差异表达分析结果导入STRING数据库进行互作关系比对,最后将构建完成的蛋白互作网络数据导入Cytoscape进行可视化处理。1.7实时荧光定量PCR验证根据转录组测序筛选获得的DEGs,提取各组感染后第3 d的脾脏总RNA,检测合格后反转录合成cDNA,进行实时荧光定量PCR验
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