基于AMPKα_SREBP...糖脂代谢的山楂果叶配伍机制_周坤.pdf
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1、西北大学学报(自然科学版)年 月,第 卷第 期,()收稿日期:基金项目:国家自然科学基金();陕西省重点研发计划项目();陕西省教育厅重点实验室项目();陕西省重点科技创新团队();陕西省教育厅服务地方专项()第一作者:周坤,男,陕西延安人,从事中药药理学研究。通信作者:赵晔,女,陕西西安人,教授,硕士生导师,从事天然药物化学及成分分析和药物代谢等研究,。中药学基于 信号通路调节糖脂代谢的山楂果叶配伍机制周 坤,王静静,李璐遥,王 鑫,申 雪,寇瑶瑶,马百平,王 梅,郑晓晖,赵 晔(西北大学 国家中医药管理局中药化学(三级)科研实验室,陕西 西安;军事医学科学院 放射与辐射医学研究所,北京;莱
2、顿大学 欧洲中医药和天然产物研究中心 生物学院,荷兰 莱顿)摘要 糖脂代谢病是由遗传、环境和精神状况引起的一种复杂性疾病,其特点是糖、脂代谢紊乱,中医学称之为“消渴症”,随着生活水平和社会压力的提高该疾病呈现多龄化趋势。中药的多组分协同增效使其在长期治疗消渴症方面具有明显优势。山楂果、叶富含有机酸和黄酮类成分,在降糖降脂方面具有显著效果。测定了山楂果、叶提取物中主要成分的含量,建立了 大鼠模型,研究了山楂果叶提取物干预 信号通路进而调节糖脂代谢的作用和机制,结合网络药理学方法分析山楂果、叶治疗 的有效成分、作用靶点和作用机制。结果表明,山楂果、叶配伍给药能更显著降低 大鼠空腹血糖血脂水平,提高
3、糖耐量水平,促进胰岛素分泌,降低脂肪堆积,缩小脂肪细胞,同时调节肝肾功能,增加肝脏 及其磷酸化水平,降低、的蛋白表达。网络药理学共筛选到 个山楂果、叶的有效成分,与疾病交集靶点共 个,参与调控 信号通路、信号通路、胰岛素抵抗等与糖脂代谢相关的多个信号通路。研究表明,山楂的果、叶配伍能够通过干预 通路,协同调节糖脂代谢,并且对于 信号通路、信号通路、胰岛素抵抗等也有调节作用,具有良好的临床应用前景。关键词 山楂果;山楂叶;网络药理学;糖脂代谢中图分类号:,(,(),;,;,),;糖脂代谢紊乱的主要特征是糖代谢紊乱与脂代谢紊乱,与 型糖尿病()、高血脂、高血压、动脉粥样硬化等心脑血管疾病密切相关,
4、对人类的健康威胁日益严重。中药在治疗糖尿病和高脂血症等疾病上有着上千年的历史。山楂果为药食同源,入脾胃经,具有消食化积之力,在改善高血脂症、动脉粥样硬化病变等疾病上具有很好的效果。中国药典 版中记载山楂叶具有“化浊降脂”的功效,可用于治疗心血管疾病。现代研究表明山楂叶具有改善 大鼠血糖血脂异常、抑制胰岛组织凋亡、促进胰岛 细胞分泌胰岛素等作用。本研究通过高脂高糖饲料喂养联合注射链脲佐菌素诱导建立 大鼠模型,研究山楂果、叶提取物基于 信号通路调节糖脂代谢的作用;基于中医整体观和辨证论治的特点,结合网络药理学所构建的基于疾病 表型 基因 药物的多层网络结构研究模式,分析山楂果、叶治疗 的有效成分、
5、作用靶点和作用机制。该研究为阐明山楂果、叶协同调节糖脂代谢作用及机制提供理论依据,并为山楂果、叶的深入开发提供基础研究支撑。实验材料和方法.仪器设备及试剂耗材 型冷冻离心机(美国);化学发光仪(上海领成);色谱柱(汉邦科技);高效液相色谱仪(日本岛津)等。色谱级甲醇、醋酸、乙腈、四氢呋喃(天 津 科 密 欧);对 照 品 牡 荆 素 葡 萄 糖 苷()、牡荆素鼠李糖苷()、牡荆 素()、芦 丁()、金 丝 桃 苷(),纯度均,购自中国食品药品检西北大学学报(自然科学版)第 卷定研究所。本文中试剂制备均为体积分数。.药材采集及药物溶液的制备山楂药材采自河北省承德市兴隆县,经鉴定为山里红()的干燥
6、成熟果实和干燥叶。山楂果去核粉碎,乙醇加热回流,得滤液,连续 次。合并 次滤液减压浓缩,取适量浓缩液于烧杯中,滴加 溶液调节山楂果浓缩液的 至 左右,抽滤得上清液。选择 型强碱阴离子交换树脂湿法装柱,纯水进行洗脱,洗脱液为无色后停止,再选用.的盐酸溶液洗脱,洗脱液用水饱和乙酸乙酯等体积萃取 次,无水硫酸钠脱水后减压浓缩,真空干燥即得山楂果提取物(,)。山楂叶采用 甲醇作为溶剂,加热回流.,过滤得滤液,连续提取 次,合并滤液,减压浓缩至 生药。使用 型大孔树脂,倍量 甲醇洗脱后洗脱液弃去;再 倍量 甲醇进行洗脱,收集洗脱液并减压浓缩,真空干燥即得山楂叶提取物(,)。采用中国药典中山楂果、叶项下有
7、机酸和总黄酮的含量测定方法进行测定,建立山楂叶 方法,色谱条件为:色谱柱(柱长 ,柱径.,粒径 ),.乙酸水 乙腈 甲醇 四氢呋喃()为流动相,等度洗脱,流速为.,柱温 ,检测波长 ,测定山楂叶提取物中主要黄酮成分的含量。山楂果提取物中有机酸含量为.。山楂叶提取物中总黄酮含量为.,其中牡荆素葡萄糖苷含量为.,牡荆素鼠李糖苷含量为.,芦丁含量为.,牡荆素含量为.,金丝桃苷含量为.。.实验动物模型的建立及给药方案 级雄性 大鼠,体质量(),购自西安交通大学医学部实验动物中心,许可证号:(陕西)。饲养于西北大学实验动物中心,许可证号:(陕)。温度(),湿度(),明暗交替各 。将大鼠分为正常对照()组
8、、模型()组,组给予标准饲料和纯净水,组给予高脂高糖饲料和葡萄糖溶液进行饮食诱导,周后,禁食 ,腹腔注射 (溶于 .柠檬酸缓冲液中),后测定血糖,血糖值.的大鼠,认为是造模成功的,同时 组按体质量腹腔注射柠檬酸缓冲液。筛选的模型鼠随机分成 组,每组 只,分别为 组、()组、()组、山楂果、叶提取物混合(,)组、阳性对照盐酸二甲双胍(,)组,组动物继续给予高脂高糖饲料,口服灌胃给药,次,连续给药 周。.检测方法及指标给药结束后,进行糖耐量实验。大鼠禁食,尾静脉采血测定血糖,灌胃葡萄糖溶液()后于.、后测定血糖值并绘制糖耐量曲线。腹腔注射浓度为 的乌拉坦溶液麻醉大鼠,测量体质量,于颈总动脉插管取血
9、,分离血浆检测总胆固醇()、甘油三酯()、高密度脂蛋白胆固醇()、低密度脂蛋白胆固醇()、胰岛素()、总胆红素()、碱性磷酸酶()、谷丙转氨酶()、谷草转氨酶()、肌酐()、尿酸()、尿素();收集肾周脂肪及睾丸周围脂肪、肝组织,称其质量。取部分脂肪组织保存在 多聚甲醛溶液中,切片观察脂肪形态学变化,其余样本置于 的条件中。.肝脏组织蛋白测定将大鼠肝组织加入预冷生理盐水研磨混匀,离心,去上清,沉淀加入含 的 和磷酸酶抑制剂的 裂解液裂解 ,离心 ,用 蛋白测试盒测定蛋白提取液浓度。加入适量蛋白上样缓冲液,沸水变性。选择 凝胶,电泳,转膜,脱脂奶粉封闭 ,孵一抗过夜。抗体分别为、磷酸化腺苷酸活化
10、蛋白激酶()、,按照说明书进行稀释。孵育二抗 ,最后 发光液发光,凝胶成像拍照分析蛋白表达。.数据分析使用 软件进行数据统计学分析,采用单因素方差分析来比较各组间差异性,以 和 软件进行数据分析,数据均以?表示。网络药理学山楂果叶活性成分基于 数据库挖掘并结合山楂果叶化学成分相关文献,对山楂果叶的活性成分进行筛选,通过 在线服务器、数据库预测相关靶点,去除重复靶第 期 周坤,等:基于 信号通路调节糖脂代谢的山楂果叶配伍机制点。数据库中收集这些成分的化学信息。数据库搜索 相关靶标,并对活性成分预测靶点和疾病靶点取交集作为潜在靶点。最后,使用 .软件建立药物 成分 靶点 疾病网络。数据库绘制 网络
11、,选择“”物种,选取得分大于.的高置信度目标蛋白质,得出 网络。将交集靶点基因导入 数据库,对核心靶蛋白的 功能和 途径进行富集分析。实验结果 大鼠体质量、血糖、体脂测定结果造模前各组大鼠体质量比较均匀,无差异。各组大鼠体质量处于稳定增长,相比 组,高脂饲料喂养下的 组大鼠体质量快速增长,给药结束后各给药组之间大鼠体质量无明显差异,但相比与 组大鼠有所改善(见图);各给药组大鼠空腹血糖值与 组大鼠血糖相比均显著性下降(.),见图;相比 组,各给药组大鼠糖耐量显著增强(见图);从图、可以看出,与 组相比,组大鼠脂肪质量和体脂指数显著升高(.),各给药组大鼠的脂肪质量和体脂指数显著降低(.)。各给
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