复合感染脓毒症大鼠模型的构建和评价_段爽.pdf
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1、2022 年 12 月第 30 卷 第 8 期中国实验动物学报ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICADecember 2022Vol.30 No.8段爽,朱瑛,赵茹茹,等.复合感染脓毒症大鼠模型的构建和评价 J.中国实验动物学报,2022,30(8):1034-1041.Duan S,Zhu Y,Zhao RR,et al.Construction and evaluation of rat models of multiple-infection sepsis J.Acta Lab Anim Sci Sin,2022,30(8):1034-104
2、1.Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2022.08.003基金项目国家自然科学基金(81960815),云南省科学技术厅联合专项(202001A2070001-032),云南中医药大学南药可持续利用研究重点实验室(202105AG070012XS2245)。Funded by the National Natural Science Foundation of China(81960815),Joint Special Project of Yunnan Provincial Department of Science and Technology(202001A20
3、70001-032),Key Laboratory of Sustainable Utilization of Southern Medicine of Yunnan University of Chinese Medicine(202105AG070012XS2245).作者简介段爽(1996),女,在读硕士研究生,研究方向:中西医结合防治疾病作用机制研究。Email:944765534 通信作者李奇峰(1977),男,硕士,副教授,研究方向:中西医临床基础。Email:375487824 复合感染脓毒症大鼠模型的构建和评价段爽1,朱瑛1,赵茹茹1,侯媛璐1,李明泓1,3,林青2,3,李奇峰
4、1,3(1.云南中医药大学基础医学院,昆明 650500;2.云南中医药大学药理教研室,昆明 650500;3.云南省高校中医治法与中药药效关系研究科技创新团队,昆明 650500)【摘要】目的 着力于解决盲肠穿刺结扎(CLP)模型因水肿肠道封堵结扎穿刺部位随机影响模型动物感染进程的问题,探索通过复合感染支架整合盲肠结扎穿刺法和植入带菌物法,建立感染可持续的脓毒症动物模型。方法 将 54 只雄性 SD 大鼠随机分为假手术组(Sham 组,n=18)、盲肠穿刺结扎组(CLP 组,n=18)、复合感染脓毒症模型组(MIM 组,n=18),其中每组 10 只用于考察各组动物一般生存状态、盲肠结扎部位
5、封堵情况和生存率;每组另 8 只用于考察各组脓毒症损伤指标。采用 HE 染色观察大鼠心脏、肝、肺、肾组织病理形态改变;取腹主动脉血检测脂多糖(LPS)、白介素-6(IL-6)、心肌钙蛋白-(cTn-I)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBil)、乳酸(Lac)和肌酐(Cr)含量;取肝组织检测丙二醛(MDA)和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)含量。结果 造模 96 h 后,Sham 组大鼠无死亡,CLP 组大鼠生存率 70%,MIM 组生存率 0%;MIM 组心脏、肝、肺、肾组织损伤程度较 CLP 模型组更为严重;MIM 组分别与 Sham 组和 CLP 组比,L
6、PS、IL-6、cTn-I、ALT、AST、TBil、Cr、Lac、MDA 含量最高,ATP 含量最低,均具有显著性差异(P 0.05);MIM 组 LPS、IL-6、TBil、MDA 等指标的变异系数较 CLP 组明显更小。结论 MIM 组可使肠内容物不断渗漏引发持续感染,反应感染和炎症的关键指标(LPS、IL-6、MDA 等)变异性远低于 CLP 组,病程进展更为一致,其模型的结构效度更好;MIM 组较 CLP 组,术后感染表现更为剧烈、器官损伤程度更深、而死亡率更高且组内死亡时间更为均一,其模型的表面效度更好,因而更符合严重感染导致机体过度反应而产生脓毒症 MODS 的临床实际。【关键词
7、】脓毒症;多器官功能障碍综合征;复合感染模型;盲肠结扎穿刺【中图分类号】Q95-33 【文献标识码】A 【文章编号】1005-4847(2022)08-1034-08Construction and evaluation of rat models of multiple-infection sepsisDUAN Shuang1,ZHU Ying1,ZHAO Ruru1,HOU Yuanlu1,LI Minghong1,3,LIN Qing2,3,LI Qifeng1,3(1.Department of Basic Medicine,Yunnan University of Tradition
8、al Chinese Medicine,Kunming 650500,China.2.Department of Pharmacology,Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500.3.Yunnan Provincial University Traditional Chinese Medicine Treatment and Traditional Chinese Medicine Efficacy Relationship Research Scientific and Technological In
9、novation Team,Kunming 650500)Corresponding author:LI Qifeng.E-mail:375487824 【Abstract】Objective We focused on solving a problem in the infection course of cecum ligation and puncture(CLP)septic model animals,i.e.,the random occlusion of ligation and puncture sites due to bowel edema.To establish a
10、septic animal model with a sustainable infection,we combined cecal ligation puncture and bacterial carrier implantation 中国实验动物学报 2022 年 12 月第 30 卷第 8 期 Acta Lab Anim Sci Sin,December 2022,Vol.30,No.8with a compound infection stent.MethodsFifty-four male SD rats were randomly divided into three group
11、s:Sham(n=18),CLP(n=18),and multiple infect model(MIM,n=18)groups.In each group,10 rats were investigated for their survival status,intra-abdominal infection,and survival rate.Another 8 rats were selected for studying related indicators of sepsis multiple organ dysfunction syndrome(MODS)injury.The de
12、tected indicators included LPS,IL-6,cTn-I,ALT,AST,TBil,Lac,and Cr abdominal aortic blood contents;MDA and ATP liver tissue contents,and HE staining of pathological changes in heart,liver,lung,and kidney tissue.Results 96 h after molding operation,there were no deaths in the Sham group,and survival r
13、ates in the CLP and MIM groups were 70%and 0%,respectively.The degrees of injury in the heart,liver,lungs,and kidneys in the MIM group were greater than those in the CLP model group.Compared with the Sham and CLP groups,the MIM group had the highest contents of LPS,IL-6,cTn-I,ALT,AST,TBil,Cr,Lac,and
14、 MDA and the lowest of ATP,all of which were significantly different(P 0.05).The coefficients of variation for LPS,IL-6,TBil,and MDA in the MIM group were significantly decreased in relation to those of the CLP group.Conclusions The MIM groups intestinal contents leaked continuously to cause persist
15、ent infection,which result ed in much lower variability in key infection and inflammation indicators(LPS,IL-6,MDA,etc.)and a more consistent course of disease than in the CLP group.Thus,the structural validity of the MIM model was better.Compared with the CLP group,the MIM group had more severe post
16、operative infections,deeper organ damage,higher mortality,more consistent within-group death times,and thus had greater face validity.Therefore,the MIM model best fits with the clinical profile of septic-MODS,which is caused by an over-reaction to severe infection.【Keywords】sepsis;multiple-organ dys
17、function syndrome;multiple-infection model;cecum ligation punctureConflicts of Interest:The authors declare no conflict of interest.脓毒症是由于严重感染引起机体过度反应而出现危机生命的多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)1-2。这一定义凸显了感染是脓毒症的明确诱因,而 MODS 是脓毒症的重要病理特征,也是脓毒症不良结局的决定性因素。由于缺乏有效治疗药物,仅我国严重脓毒症患者病死率高达 50%,每
18、年的医疗费约为 46 亿美元3-5,由此造成沉重经济和社会负担。缺乏稳定、贴近临床的动物模型,使脓毒症病理生理学和相关药物研究受到较大限制6-7。历经数十年的脓毒症药物研发,均以失败告终。因此,建立稳定能够高度模拟人类脓毒症病理生理过程的脓毒症动物模型对脓毒症研究至关重要。目前盲肠结扎穿刺(cecum ligation and puncture,CLP)动物模型是脓毒症研究的经典模型,因具有血流动力学、代谢过程、炎症反应阶段等与人类脓毒症类似的临床表现。然而,良好的脓毒症动物模型除需模拟人类脓毒症的临床表现,还需能够模拟人类脓毒症的病程发展。但实践中发现,经典 CLP 模型脓毒症大鼠由感染造成
19、肠道水肿并封堵盲肠穿刺结扎部位,此过程会受到诸多因素的影响并随机发生,导致部分模型动物的感染过程延缓或终止,进而造成相同造模条件下的模型动物差异性大的结果8-11。此外,考察药物对脓毒症的影响,如不能排除 CLP 模型肠道随机封堵穿刺结扎部位的问题,就很难确认药物的实际效用。据此,本研究以 CLP 模型为基础,着力解决 CLP 模型因水肿肠道封堵结扎穿刺部位随机影响模型动物感染进程的问题,探索通过复合感染支架整合盲肠结扎穿刺法和植入带菌物法,建立感染可持续的脓毒症动物模型,即复合感染脓毒症模型(multiple infect model,MIM)。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物
20、54 只 8 周龄 SPF 级雄性 SD 大鼠,体重(230 20)g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司【SCXK(湘)2019-0004】,于采光通风良好,温度 20 26,相对湿度 42%62%的室内适应性饲养6 d 后进行实验,饲养于云南中医药大学实验动物部【SYXK(滇)K2017-0005】。随机分为假手术组(Sham 组)、盲肠穿刺结扎组(CLP 组)、复合感染模型组(MIM 组)每组各 18 只,以上各组再随机分为生存率组每组 10 只和实验组每组 8 只。研究流程均符合云南中医药大学实验动物伦理委员会要求(R-062021135)。1.1.2 主要试剂与仪器10%鼠粪混悬液(
21、10 g 大鼠新鲜粪便+0.02 g连二亚硫酸钠+90 mL 生理盐水,600 r/min 离心 10 min,取上清,-20冰箱冷冻保存备用)。5301中国实验动物学报 2022 年 12 月第 30 卷第 8 期 Acta Lab Anim Sci Sin,December 2022,Vol.30,No.8脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)试剂盒(泉州睿信,20210720);白介素-6(interleukin6,IL-6)试剂盒(泉州睿信,20210809);乳酸(lactic acid,Lac)试剂盒(南京建成,20210707);丙氨酸氨基转移酶(alanine
22、aminotransferase,ALT)试剂盒(南京建成,20210524);天 冬 氨 酸 氨 基 转 移 酶(aspartate aminotransferase,AST)试 剂 盒(南 京 建 成,20210518);心肌肌钙蛋白 I(cardiac troponinI,cTn-I)试剂盒(Elabscience,20210806);肌酐(creatinine,Cr)试剂盒(南京建成,20210708);总胆红素(total bilirubin,TBil)试剂盒(南京建成,20210730);丙二醛(malondialdehyde,MDA)试 剂 盒(南 京 建 成,20210702)
23、;腺 嘌 呤 核 苷 三 磷 酸(adenosine triphosphate,ATP)试剂盒(碧云天,012521210621);抗凝剂(康卫仕,20201012)。冰冻切片机/MEV(莱比信,中国);包埋仪1100 mm 500 mm 380 mm/YD-6L(益迪医疗,中国);玻片扫描影像系统 TeksqraySQS-1000(eksqray,中国);多功能酶标仪 InfiniteM200PR0(TECAN,瑞士)。图 2 建立复合感染模型步骤Figure 2 Steps to establish a multiple infection model1.1.3 主要器材和设备复合感染支架
24、(自制参见图 1),通过复合感染支架整合盲肠结扎穿刺法和植入带菌物法。盲肠穿刺部位固定于支架通孔一侧,辅助以通孔处呈均匀分布的突起,二者协同可阻碍水肿肠道封堵盲肠结扎穿刺部位;其次通过向固定在支架上的棉球滴加粪便提取液,干扰远端水肿肠道对盲肠结扎部位的封堵。最终达到建立稳定而可持续感染的脓毒症动物模型的目的。1.2 方法1.2.1 模型制作术前 14 h 禁食不禁水。麻醉满意后腹部中下图 1 复合感染支架图Figure 1 Multiple infect model stent diagram部铺放洞巾,75%乙醇消毒,从尿道口上 1 cm 处沿腹中线切开约 2.5 cm 纵行切口,用钝性无菌
25、解剖镊探查腹腔,暴露盲肠,避开血管分离肠系膜,距盲肠末端 1 cm 处用 3/0 型号手术缝合线结扎,将结扎部固定于复合感染模型支架中心部位,然后轻提起结扎盲肠,用 21 G 针在结扎部位从上向下螺旋状穿刺三针六孔,每针旋转 30,两针之间上下间隔约3 mm。穿刺盲肠挤出少量粪便,用消毒签擦去挤出的粪便。在复合感染支架预先固定的两个 0.03 g棉花上各滴加 10%鼠粪混悬液 0.3 mL。轻提腹腔切口,将复合感染支架放入腹腔并尽量至于腹腔底部。最后逐层缝合切口。将术后大鼠置于笼中直至麻醉苏醒,正常饲养。所有动物手术在 20 min 内完成,保持一致性。CLP 组:不安放复合感染支架和滴加鼠粪
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