DEHP和高脂暴露对小鼠脑...酸类神经递质、神经元的影响_郑刘根.pdf
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1、实验研究 和高脂暴露对小鼠脑组织氨基酸类神经递质、神经元的影响郑刘根,单姗,程东,李慧,姚文环,赵秀兰,张天亮(通信作者)山东大学公共卫生学院毒理与营养学系,山东 济南 ;山东省疾病预防控制中心卫生检验检测所;山东省疾病预防控制中心基金项目:国家自然科学基金资助项目(,);山东省重点研发计划(重大科技创新工程)项目()作者简介:郑刘根(),男,硕士,研究方向:卫生毒理学通信作者:张天亮,:摘要:目的观察长期低剂量邻苯二甲酸二(乙基己基)酯(),暴露及高脂喂养对小鼠脑组织氨基酸类神经递质和神经元的影响。方法选择体质量 级雌性 小鼠,适应性喂养周,随机分为对照组(组)、组(组)、高脂组(组)、暴露
2、联合 喂养组(组)。组和 组小鼠经口给予 ,组、组小鼠给予等体积溶剂,组、小鼠喂饲普通维持饲料,组、组小鼠喂饲高脂饲料。第 周末,每组随机取只小鼠脱臼处死,取脑组织制备匀浆,并采用高效液相色谱法检测脑组织氨基酸类神经递质水平;每组剩余只小鼠经体内灌注固定,制备大脑冰冻切片,采用尼氏染色观察神经元的变化。结果 组大脑皮层 高于 组、组,组、组 低于 组();各组其他指标比较差异无统计学意义()。各组中脑中氨基酸类神经递质水平比较差异无统计学意义()。组、组、组小脑 均高于 组,组 高于 组、组、组();各组其他指标比较差异无统计学意义()。与 组相比,组、组及 组小鼠大脑神经元中尼氏体颜色变淡、
3、着色颗粒稀疏,以 组最为明显。结论 长期暴露和高脂饮食可破坏小鼠脑内氨基酸类神经递质的内稳态,导致神经元损伤。关键词:邻苯二甲酸二乙基己酯;高脂饮食;氨基酸类神经递质;神经毒性;脑组织 :中图分类号:文献标识码:文章编号:(),;,;:()()()(),(),(),(),(),(),();(),(),预防医学论坛 年月第 卷第期 ,();(),:;邻苯二甲酸酯(,)是目前使用最多的增塑剂,广泛应用于装修材料、儿童玩具、化妆品、食品包装及医疗用品中,其中,邻苯二甲酸二乙基己酯(),的使用量约占 的 。极易从塑料母体释放到环境中,可通过呼吸道、消化道和皮肤进入人体。研究显示,一般人群平均每日 摄入
4、量为 ,我国规定 的可耐受每日摄入量为 ,人类母乳、血液和尿液中均可检测到 及代谢产物。流行病学研究显示,儿童尿液 及其代谢产物水平 与智力评分 及认知功能呈 负相关。采用秀丽线虫的研究显示,早期慢性 暴露可加重秀丽线虫因衰老导致的长期记忆下降。连续个月通过饲料给予 大鼠 的 ,可导致大鼠的空间学习记忆受损。雌性小鼠孕期经口暴露 的 ,其子代小鼠表现出情绪焦虑、空间和识别记忆下降等行为学改变,伴随海马椎体神经元变性。这些研究提示 可能具有神经毒性,但机制尚不明确。研究显示,一些环境污染物通过影响脑内兴奋性和抑制性氨基酸类神经递质水平及其稳态引起神经系统损伤。兴奋性氨基酸类神经递质主要包括谷氨酸
5、(,)、天冬氨酸(,)、抑制性氨基酸类神经递质包括氨基丁酸(,)、甘氨酸(,)。牛磺酸(,)在大脑中广泛存在且对大脑具有重要的保护作用。大脑内兴奋性和抑制性神经递质间的平衡状态决定了神经元的兴奋性,神经递质内稳态失衡与神经退行性病变、脑损伤和认知功能损伤密切相关。目前研究显示,高脂饮食与 肥 胖 也 被 证 明 与 中 枢 神 经 功 能 障 碍 密 切 相关 。已知饮食是机体内 的主要来源,日常生活中 暴露和高脂饮食多同时存在。本实验采用 雌性小鼠,分别给予普通饲料和高脂饲料喂养,同时连续 周经灌胃给予 。部分动物脱臼处死后迅速分离脑组织,采用高效液相色谱法(,)检测脑内种氨基酸酸类神经递质
6、水平,部分动物经体内灌注固定,制备冰冻切片,经尼氏染色观察脑组织神经元的变化,探索 神经毒性的潜在机制。材料与方法 动物、试剂及仪器 级雌性 小鼠 只,体质量 ,购自北京华阜康生物科技有限公司,动物生产许可证号为 (京)。普通维持饲料(,脂肪供能比)和高脂饲料(,脂肪供能)均购自美国 公司。实验动物饲养于屏障环境,实验动物使用许可证号 为 (鲁)号,环 境 温 度(),环境相对湿度(),明暗循环 ,可自由进食及饮水,适应性喂养。本实验研究符合 美 国 国 立 卫 生 研 究 院(,)实验动物使用的伦理和福利要求,实验方案经过山东大学公共卫生伦理学委员会审批(审批号 )。色谱纯甲醇和乙腈购自上海
7、国药集团化学试剂有限公司,天冬氨酸()、谷氨酸()、甘氨酸()、氨基丁酸()和牛磺酸()标准品购自北京索莱宝科技有限公司,所有其他化学试剂均为市售分析纯以上。型高效液相色谱仪及 (,)色谱柱(日本岛津株式会社),生物样品匀浆仪(杭州奥盛仪器有限公司),数字切片扫描仪 (匈牙利 公司)。动物分组及处理随机分为对照组(组)、组(组)、高脂组(组)、暴露联合 喂养组(组),各 只。组、组每日经口给予玉米油稀释的,剂量为 、体积 。组、组给予等体积玉米油灌胃。组、组喂饲普通维持饲料,组、组喂饲高脂饲料。连续 周。观察指标 脑组织中种氨基酸类神经递质水平检测采用 对脑组织中 、和 进行测定。检测条件如表
8、。流动相为 的醋酸钠缓冲溶液(值为 )与体积分数 的乙腈溶液,具体梯度洗脱程序如表。预防医学论坛 年月第 卷第期 ,表 检测条件参数数值参数数值检测器光电二极阵列管检测器流量 柱温 进样量 色谱柱 检测波长 表梯度洗脱程序时间()醋酸钠缓冲液()乙腈溶液()标准曲线制备:配制分别含有、和 的混合标准系列溶液,取以上混合标准系列溶液 ,分别与 的碳酸氢钠溶液和 的,二硝基氟苯(,)溶液充分混合,暗反应 。反应后按照上述检测条件进行检测,分别根据标准系列的浓度及相应的峰面积,建立回归方程。样品检测:实验结束后,每组随机取只小鼠脱臼处死,迅速剥离脑组织。分别称取约 的大脑皮层、中脑及小 脑 组 织,
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