靶向Op18_stathmin的RNAi联合Taxol调控ERK信号通路和p53蛋白对鼻咽癌细胞增殖的抑制作用.pdf
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1、中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生 67 靶向 Op18/stathmin 的 RNAi 联合 Taxol 调控 ERK 信号通路和 p53 蛋白对鼻咽癌细胞增殖的抑制作用 余 婷 长沙医学院,湖南 长沙 410219 摘要:摘要:鼻咽癌是一种难治性的肿瘤,很难进行手术切除;单纯的化疗优于放射治疗。但化疗耐药的产生是鼻咽癌化疗失败的主要原因之一。Op18/stathmin 是一种微管不稳定蛋白,与肿瘤密切相关,可能成为恶性肿瘤治疗的潜在靶点。紫杉醇被广泛应用于临床各类恶性肿瘤化疗,但易产生抗性。ERK 与 p53 与肿瘤细胞的增殖、移行密切相关。本研究以鼻咽癌 CNE1 细胞株为研究模型,采
2、用靶向 Op18/stathmin 的 RNA 干扰联合 Taxol 处理,探讨靶向 Op18/stathmin 的 RNAi 联合 Taxol 调控 ERK 信号通路和 P53 蛋白抑制鼻咽癌细胞增殖的作用机制。研究发现,靶向 OP18/stathmin 的 RNA 干扰,能抑制细胞增殖、集落形成与移行,下调 ERK 表达,增强 p53 表达。这些结果提示靶向 Op18/stathmin 的 RNA 干扰,能为 Taxol 耐药性鼻咽癌治疗提供新的思路。关键词:关键词:Op18/stathmin;RNA 干扰;Taxol;鼻咽癌;ERK;p53 中图分类号:中图分类号:R739.63 鼻咽癌
3、是一种头颈部恶性肿瘤,常见于鼻咽的顶部,早期即可发生颈部淋巴结转移。有明显地域性,好发于中国南方省份和东南亚地区的。其治疗手段有手术切除,放疗联合化疗1。由于鼻咽部位置隐秘,很难进行手术切除;放射治疗会造成正常细胞损伤,且鼻咽癌转移早,放疗仅为局部治疗,化疗对全身治疗效果明显好于局部的放射治疗,特别是对放射耐受弱,有明显淋巴结转移,或转移范围广的晚期患者,单纯的化疗优于放射治疗。但化疗本身也有一定的局限,化疗耐药的产生是鼻咽癌化疗失败的主要原因之一2-3。Op18/stathmin 是近年来研究较多的一种高度保守的细胞内可溶性磷酸蛋白质,相对分子质量为 18-19KD。它又称为微管不稳定蛋白,
4、属于微管相关蛋白,能调节微管的解聚。通过调节微管动力,与多种细胞因子、癌基因、抑癌基因的表达产物直接或间接作用,在细胞分裂和增殖中具有关键性调控作用,在调节信号传导与控制微管聚合中扮演着一个非常重要的角色4。Op18/stathmin 蛋白在多种恶性肿瘤中呈高表达,如胃癌、肺癌、食管鳞癌、宫颈癌、鼻咽癌等,且与肿瘤的预后密切相关,可能成为恶性肿瘤治疗的潜在靶点5-9。紫杉醇(Taxol)是一种具有高度亲脂性的细胞毒性抗上皮源性肿瘤的植物类化疗药物。Taxol 通过增强微管(microtubule,MT)聚合,抑制其解聚,干扰 DNA结合,来阻断细胞周期进程,抑制肿瘤细胞的增殖,诱导细胞凋亡,最
5、终控制病情进展和肿瘤转移,延长患者的生存期。被广泛应用于临床各类恶性肿瘤化疗。尽管它在临床上取得了成功,但肿瘤对用于治疗的药物产生耐药性仍然是癌症治愈的主要障碍,目前已出现多种对 Taxol 耐药的肿瘤10-13。丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPK)中的细胞外信号调节激酶(ERK),能调节多种细胞过程的关键信号通路,与细胞增殖、分化、凋亡和应激反应密切相关。ERK 的表达对肿瘤的发展至关重要,其过度活化在癌症的发展和进展中起着重要作用14。p53 是一种重要的肿瘤抑制因子,p53 功能的丧失往往是癌症发展的先决条件。突变的 p53 蛋白可以作为稳态因子,感知和保护癌症细胞免受转化相关应激刺激,包
6、括 DNA 损伤、代谢失衡、与肿瘤微环境的相互作用以及免疫系统的影响,从而有利于癌症细胞的生存和肿瘤进展15。本研究的研究模型为鼻咽癌 CNE1 细胞株,采用RNA 干扰(RNA interference,RNAi)沉默靶向Op18/stathmin 的表达,联合 Taxol 处理,探讨靶向Op18/stathmin 的 RNAi 联合 Taxol 调控 ERK 信号通路和 P53 蛋白抑制鼻咽癌细胞增殖的作用机制。1 材料与方法 1.1 细胞株与细胞培养 中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生 68 人鼻咽癌 CNE1 细胞株,生长在 375%CO2的湿润环境中。培养基制备:RPMI1640(
7、Hyclone)+10%胎牛血清(Hyclone)+100IU/mL 青霉素+100LG/mL 链霉素。1.2 试剂与抗体 紫杉醇(sc-201439)自 Santa Cruz 公司购得,用 DMSO(为 solarbio 公司产品)溶解到适当的浓度,20保存。一抗有兔抗stathmin 抗体,兔抗ERK1(C16)抗体,兔抗 P53 抗体(均购自 calbiochem 公司),二抗包括兔抗鼠 IgG-HRP,羊抗兔 IgG-HRP(均购自 Santa Cruz 公司)。1.3 质粒的构建及转染 RNA 干扰沉默靶向 Op18/stathmin 的质粒构建参考我们以前的研究16。Blank 质
8、粒(pGCsi.U6/neo/GFP)是一个空质粒;Non 质粒(pGCsi.U6/neo/GFP-NON)是指在 Blank 质粒的基础上插入不编码任何基因序列的质粒;RNAi 质粒(pGCsi.U6/neo/GFP-RNAi)是在 pGC-silencer-U6/Neo 质粒的 BamH I 和 Hind III 限制性内切酶位点之间插入针对 Op18/stathmin 编码区AGAGAAACTGA CCCACAAA 的序列(374-393)片段(所有质粒均由上海 GENECHEM 提供)。按 LipofectamineTM 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)
9、转染说明,将质粒转染入细胞中。本实验分为三组,Blank 组指仅转染 Blank 质粒组,Non 组指仅转染 Non 质粒组,RNAi 组指仅转染 RNAi 质粒组。1.4 集落形成实验 细胞转染 Blank,Non,RNAi 三组质粒后接种(3103/孔)在含培养基的 6 孔板中,待细胞贴壁后加入 10nM 紫杉醇,连续培养 2 周,至 6 孔板中出现肉眼可见的克隆时终止培养。弃去培养基,用 PBS 洗涤 2次,使用甲醇固定 10 分钟,并用 0.1%结晶紫染色,细流水冲洗染液,利用空气干燥法使之干燥。照片是用Leica DMCI 显微镜(雷卡,德国)在4 倍物镜下拍摄。1.5 划痕实验 细
10、胞转染 Blank,Non,RNAi 三组质粒后接种(5105/孔)在含培养基的 6 孔板中,待细胞贴壁后加入 10nM 紫杉醇,用 200ul 的 Tip 头沿直径或平行于直径划痕,在 0、12、24、36hr 不同时间点用倒置显微镜照相。细胞迁移能力是根据细胞迁移到划痕试验区的恢复程度来评估的。1.6 MTT 检测 细胞转染 Blank,Non,RNAi 三组质粒后接种(5103/孔)在含培养基的 96 孔板中,每组设置 4 个平行孔,待细胞贴壁后加入 10nM 紫杉醇。每组细胞分别培养 0,24,48,72 小时。每个孔加入 MTT 试剂 20l(为 solarbio 公司产品),并继续
11、在 37下放置 4 小时培养,再吸出染料,加入 100l DMSO,摇床摇 10分钟,使用酶标仪 490nm 处读取吸光度。生长曲线计算方式为:相对细胞存活率%=(OD 测试/OD 对照)100%,OD 表示光密度值。1.7 Western-blot 检测 收获生长状态佳的细胞,使用裂解缓冲液(50mM 的Tris-HCl,1mM 的 EDTA,2SDS,5mM 的 DTT,10mM 的PMSF)超低温裂解 30min,并实施 30s 超声粉粹。10,000rpm15min,4oC 离心,收集所有上清用于 Western-blot 检测分析。通过 BCA 法测定蛋白浓度,蛋白提取物 50 g
12、样本,使用 10%12%SDS-PAGE 电泳分离,然后电转移至硝酸纤维膜,将膜用含有 5%Tween-20 脱脂奶粉 PBS 封闭 2 小时,加入一抗进行孵育,4oC 过夜,再加二抗室温孵育 1-2 小时,用增强化学发光检测试剂盒(Pierce,美国)发光。2 统计学分析 用 SPSS22.0 统计软件包对数据进行处理,数据表示均数标准差,p0.05 则表明差异有统计学意义。3 结果 3.1 RNAi 促进 Taxol 抑制 CNE1 细胞的集落形成能力 集落形成实验证实:在 Blank 与 Non 组有明显的集落形成,集落之间边界不清,有融合现象,而在 RNAi组也有小个集落形成,集落之间
13、的间距较大,稀疏分布(图 1)。图 1 比较不同处理条件下 CNE1 细胞集落形成的形态学图片(原始放大40)中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生 69 3.2 RNAi 联合Taxol 诱导,抑制CNE1 细胞的移行 划痕实验显示,在 Blank、Non、RNAi 三组细胞中,处理 12 小时后发现,Blank、Non 组有明显愈合现象,RNAi 组没有明显改变;24 小时后,Blank、Non 伤痕完全愈合,而 RNAi 组改变不明显;处理 36 小时后,Blank、Non 组细胞生长紧密,RNAi 组依然存在大面积伤痕,相对于 Blank、Non 组修复现象弱很多。(图 2)。这些表明
14、RNAi 联合 Taxol 抑制 CNE1 细胞的二维平面迁移能力。图 2 不同时间点 CNE1 细胞的划痕修复检测(原始放大100)3.3 RNAi 联合 Taxol 处理,抑制 CNE1 细胞增殖能力 MTT 实验结果表明,CNE1 细胞在恒定 Taxol 处理24 小时后,生长曲线都成明显下降趋势,Blank 和 Non组之间的下降幅度无明显差异,RNAi组相对于Blank、Non 下降最明显,下降梯度最大;48 小时处理后,Blank和 Non 继续下调,二者的生长情况无明显差异,RNAi下降幅度在三组中最大;72 小时连续培养发现,曲线呈一定程度的下调,与 Blank、Non 组相比
15、,RNAi 组生长曲线相对于 48 小时下降的程度更明显(图 3A)。RNAi联合 Taxol 作用,能抑制 CNE1 细胞增殖能力。统计学分析显示,在 24 小时、48 小时和 72 小时三个不同时间点 Blank、Non、RNAi 都存在明显抑制现象,Blank与Non组之间无明显改变,RNAi组与Blank、Non 组进行比较存在显著差异(P0.05),RNAi 抑制程度更大(图 3B)。图 3 MTT 法检测不同处理条件下 CNE1 细胞相对增殖率 注:A:不同处理组在不同时间点的生长曲线;B:不同处理组在不同时间点相对增值率的统计学分析(*表示P0.05)。图 4 western-b
16、lot 分析 RNAi 联合 Taxol 处理对 CNE1 细胞 ERK 与 P53 蛋白表达的调控 中文科技期刊数据库(全文版)医药卫生 70 3.4 RNAi 联合 Taxol 处理,调控 ERK 和 P53 蛋白的表达 western-blot 分析恒定 Taxol 处理下,在 Blank组与 Non 组之间,OP18 表达无明显改变,RNAi 组OP18/stathmin 表达不明显,靶向 OP18/stathmin 的RNAi 有效地抑制了 OP18/stathmin 的表达。进一步分析发现,RNAi 阻断 OP18/stathmin 表达,会导致 ERK的表达随之下调,但 Blan
17、k、Non 组 ERK 表达无明显差异。P53 蛋白表达在 Blank 组与 Non 组之间相似,RNAi组 P53 蛋白表达上调(图 4)。4 讨论 随着 Taxol 在临床上广泛应用,肿瘤细胞中多种凋亡抑制蛋白的高表达,导致肿瘤细胞对 Taxol 毒性反应不敏感17。研究学者一直尝试通过 Taxol 与其他药物联用达到杀灭肿瘤与减轻患者的毒副作用目的。如顺铂(cisplatin)与 Taxol 联用治疗胆管癌;Taxol联合吉西他滨(gemcitabine)治疗乳腺癌;长春新碱(vincristine)与 Taxol 联用治疗肺癌等18-20。研究结果发现 Taxol 与这些传统化疗药物的
18、联用,对肿瘤患者的疗效有一定的提高,但药物毒副作用却更严重,成为新的治疗瓶颈。OP18/stathmin 目前已经明确为一个细胞信号转导分子。其在细胞分化、组织再生修复及在神经系统的发育具有重要意义,且 OP18/stathmin 与恶性肿瘤发生、发展及肿瘤细胞对化疗的敏感性意义非凡。基于OP18/stathmin 在肿瘤中的作用,许多学者已经开展把其运用到肿瘤治疗中的研究。如在卵巢癌中诱导OP18/stathmin 磷酸化,降低了其活性,以达到增强Taxol在 卵 巢 癌 中 的 抗 增 殖 作 用21;沉 默OP18/stathmin 可以在体外调节肝癌细胞增殖、迁移以及在体内调节肿瘤生长
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