白茅根黄酮纯化工艺及抗运动疲劳作用研究.pdf
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1、662023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究收稿日期:2022-09-14基金项目:陕西省教育厅科学研究计划项目(19JK0510)。作者简介:蔡珊(1989-),女,硕士研究生,讲师,研究方向:运动营养。白茅根黄酮纯化工艺及抗运动疲劳作用研究蔡珊(西安科技大学,西安 710054)摘 要:采用大孔树脂纯化白茅根黄酮提取物,并比较不同产物的抗运动疲劳活性。通过静态吸附-解吸试验筛选适宜的色谱柱型号后,采用单因素试验探讨大孔树脂纯化白茅根黄酮提取物的最佳工艺条件,并利用动物试验考察不同产物的抗运动疲劳活性。结果表明,AB-8 型大孔树脂纯化白茅根黄酮的最佳条
2、件为上样液浓度 2.0 mg/mL、上样液 pH 5.0、上样液体积 60 mL、上样流速 2.0 mL/min、洗脱液乙醇的体积分数 70%、洗脱流速 1.0 mL/min、洗脱液体积 100 mL,所得产物中黄酮化合物的含量为(64.2 1.5)%,约为纯化前2.24 倍。动物试验结果显示,中、高剂量的白茅根黄酮纯化产物可明显延长小鼠的力竭游泳时间,降低体内乳酸与尿素氮的生成量并增加肝、肌糖原储备量,同时显著改善体内超氧化物歧化酶与谷胱甘肽过氧化物酶的活力,从而可知纯化后的白茅根黄酮产物具有较好缓解运动疲劳的作用。关键词:白茅根;黄酮;纯化;抗运动疲劳;小鼠中图分类号:TS 201.4/R
3、284.2 文献标识码:A 文章编号:1006-2513(2023)09-0066-08doi:10.19804/j.issn1006-2513.2023.09.009Purification of flavonoids from Rhizoma imperatae and its anti-fatigue activity CAI Shan(Xi an University of Science and Technology,Xi an 710054)Abstract:The flavonoids extracted from Rhizoma imperatae was purified b
4、y macroporous resin and the anti-fatigue activity of different products was compared.Static adsorption-desorption test was used in selecting the optimum macroporous resin.Then single factor tests were used to optimize flavonoids extract from Rhizoma imperatae.The anti-fatigue activity of different p
5、roducts was investigated by animal experiments.The results showed that the optimum conditions for purification of flavonoids of Rhizoma imperatae by AB-8 macroporous resin were:sample solution 60 mL,concentration 2.0 mg/mL,pH 5.0,flow rate at 2.0 mL/min,and eluted with 70%ethyl alcohol 100 mL at 1.0
6、 mL/min flow rate.Under these conditions,the flavonoid content after purification was(64.21.5)%,which was approximately 2.24 times more than that of before the purification.The animal experiments indicated that the purified flavonoids at medium-dose and high-dose significantly prolonged mice exhaust
7、ive swimming time,decreased the lactic acid and urea nitrogen content in mice serum,and increased the reserve capacity of liver glycogen and muscle glycogen in liver and muscular tissue respectively.In addition,the activity of superoxide dismutase and glutathione peroxidase was improved obviously in
8、 the liver tissue.Therefore,flavonoids from Rhizoma imperatae after purification could reduce exercise fatigue.Key words:Rhizoma imperatae;flavonoids;purification;resisting exercise fatigue;mice672023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究运动性疲劳是在高强度运动下,机体不能维持预定的运动强度,究其原因主要有“能量耗竭”、“代谢产物蓄积”和“氧化应激”三种主流假说1-
9、2。高强度运动时,体内一方面磷酸肌酸、糖原、血糖和脂肪的消耗加快,造成大脑能量供应不足,从而抑制中枢神经传导;另一方面乳酸、酮体、NH3等代谢产物的含量急剧升高,使得肌肉收缩能力下降,机体的运动耐力受到影响,同时自由基生成量增多,破坏了体内氧化剂与抗氧化剂之间的平衡稳态,使得血管扩张被抑制,血液流量下降,进一步降低了身体各器官和大脑的供氧,致使疲劳感愈发强烈3-4。白茅根为禾本科多年生草本植物白茅的根茎,具有药食两用特性,富含三萜类、有机酸类、多糖类、黄酮类等物质,具有抗菌、抗炎、抗氧化及增强机体免疫等活性5-6。有研究显示,黄酮类化合物抗氧化性较好,可提高体内抗氧化酶的活力,具有一定的抗运动
10、疲劳作用7-9,而白茅根黄酮类化合物对 DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼)自由基的清除率和还原力均高于相同浓度的抗氧化剂 BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚),表现出较好的抗氧化作用10,特别是以白茅根水提物为原料制备的白茅根金银花凉茶饮料,不仅可延长小鼠的负重游泳时间,还能降低剧烈运动后体内的乳酸与尿素氮浓度水平,具有一定的抗疲劳作用11。因此,本研究拟通过动物实验考察白茅根黄酮类化合物的抗运动疲劳活性,但其提取物中仍含有较多鞣质、色素等杂质,而大孔树脂常被用于黄酮类物质的分离纯化,于是首先探讨大孔树脂纯化白茅根黄酮提取物的最佳工艺条件,随后比较不同产物的抗运动疲劳活性,从而为白茅根
11、的深度开发与利用提供参考。1 材料与方法1.1 材料与试剂白茅根采购于西安康乐药房,经鉴定为禾本科植物白茅的根茎;芦丁标准品:中国食品药品检定研究院(批号:100080-201811);D101、AB-8 型大孔树脂:天津市西金纳环保材料科技有限公司;HPD-100、HPD-400、X-5 型大孔树脂:天津浩聚树脂科技有限公司;XAD-16型大孔树脂:罗门哈斯公司,乳酸(lactic acid,LA)试剂盒、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)试剂盒、肝糖原(liver glycogen,LG)试剂盒、肌糖原(muscle glycogen,MG)试剂盒、超氧化物歧化酶(s
12、uperoxide dismutase,SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)试剂盒:南京建城生物工程研究所;其他试剂均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;试验用水为蒸馏水。动物信息:健康雄性白色豚鼠 100 只,体质量 2026 g,陕西师范大学实验动物中心 动物使用许可证号:SYXK(陕)2021-003。1.2 仪器与设备DFY-1000D 型破壁机:温岭林大机械有限公司;FA2204B 型电子天平:上海越平科学仪器有限公司;WT600-2J 型蠕动泵:兰格恒流泵有限公司;AS-LGJ-10A 型立式冷冻干燥机:郑州安晟科学仪器有
13、限公司;KH-22 型离心机:湖南凯达科学仪器有限公司。UV-1700SPC 型紫外-可见分光光度计:上海美析仪器有限公司;RE-5299 型旋转蒸发仪:上海耀特仪器设备有限公司;TP-20C 型恒温振荡器:上海靳澜仪器制造有限公司。1.3 方法1.3.1 白茅根黄酮提取物白茅根经 60干燥后粉碎,过 60 目筛。在料液比 125(g/mL)下,称取一定质量的白茅根粉末置于体积分数为 70%乙醇溶液内,并在一定的超声波(功率:530 W)下提取 30 min 后过滤,旋转蒸发滤液中的溶剂后,置于冷冻干燥机中干燥,即得白茅根黄酮提取物浸膏12。1.3.2 产物中黄酮含量测定准确称取芦丁标准品 1
14、5 mg,采用体积分数为 70%乙醇溶液溶解并定容至 50 mL 容量瓶内,配制成 0.3 mg/mL 芦丁标准品储备液,分别准确移取 0.5、1、2、3、5 mL 储备液至 10 mL容量瓶中,移入 5%亚硝酸钠溶液 0.5 mL 后静置 5 min,继续移入 10%硝酸铝溶液 0.5 mL 后静置 5 min,再加入 5%氢氧化钠溶液 2 mL 后,加入 70%乙醇溶液至刻度线,定容摇匀,静置 10 min 后,于 510 nm 波长处测定各样品的吸光度,682023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究以芦丁的质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线
15、,得到标准曲线方程:y=5.12 x+0.012,r=0.9999。另外分别将样品溶液稀释至一定体积后,在相同波长下测定吸光度,通过标准曲线方程,测得样品中黄酮含量13。1.3.3 树脂型号筛选取 不 同 型 号(D101、AB-8、HPD-100、HPD-400、X-5 和 XAD-16)的大孔树脂适量经过醇溶液预处理后,滤纸吸干。准确称取 5.0 g树脂置于锥形瓶内,加入 50 mL 含有 1.0 g 提取物的溶液,置于 30下恒温振荡 24 h 至大孔树脂饱和吸附后过滤,测定上清液中黄酮含量后,计算吸附率。吸附后的树脂经适量水冲洗、滤干后,置于锥形瓶中,加入体积分数为 70%乙醇溶液 5
16、0 mL,置于 30下恒温振荡 24 h 后过滤,测定上清液中黄酮含量,计算不同树脂的解吸率及黄酮化合物的回收率14。吸附率/%=100%C0V0-C1V1C0V0 (1)解吸率/%=100%C2V2C0V0-C1V1 (2)回收率/%=100%C2V2C0V0 (3)式中:C0为溶液中初始黄酮浓度,mg/mL;V0为吸附前溶液体积,mL;C1为吸附后溶液中黄酮浓度,mg/mL;V1为吸附后溶液体积,mL;C2为解吸后溶液中黄酮浓度,mg/mL;V2为解吸后溶液体积,mL。1.3.4 纯化条件研究1.3.4.1 动态吸附条件考察 根据预实验结果,考察上样液浓度、上样液 pH 与体积及上样流速对
17、大孔树脂吸附白茅根黄酮化合物的影响,具体为在湿法装有 10.0 g 树脂的层析柱(1.5 cm 34 cm)内采取如下操作:(1)pH 5.0 上样液 60 mL 以 2.0 mL/min 流速上样,考察不同上样浓度(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)对大孔树脂吸附率的影响;(2)固定上样浓度 2.0 mg/mL、上样液体积 60 mL、上样流速 2.0 mL/min,采用盐酸或氢氧化钠调节溶液 pH,考察不同上样液 pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)对大孔树脂吸附率的影响;(3)绘制不同流速(1.0、2.0、3.0 mL/min)树脂的泄漏曲线,考察上样流速与上
18、样液体积对树脂吸附黄酮化合物的影响。1.3.4.2 动态洗脱条件考察 固定洗脱流速 1.0 mL/min,采用 100 mL 洗脱液对相同条件吸附黄酮化合物后的树脂进行洗脱,考察不同体积分数(50%、60%、70%、80%、90%)乙醇溶液对黄酮化合物的解吸率。另外,以体积分数为 70%乙醇溶液作洗脱液,考察不同流速(1.0、2.0、3.0 mL/min)对树脂内黄酮化合物的洗脱曲线。1.3.5 抗运动疲劳活性考察1.3.5.1 动物分组与灌胃剂量 将100只小鼠经适应性喂养 1 周后,使用随机数字表平均分为五组,即空白对照组、提取物组、纯化物低、中、高剂量组。参考相关文献的灌胃剂量,以生理盐
19、水作溶 剂,配 制 50 mg/kg、100 mg/kg 和 200 mg/kg 的白茅根黄酮纯化物,分别作为纯化物低、中、高剂量组动物灌胃黄酮溶液的浓度,而提取物组动物则灌胃浓度为 200 mg/kg 的白茅根黄酮提取物溶液,空白对照组灌胃生理盐水,各组的灌胃体积均以 0.2 mL/10 g(鼠重)换算,每日定时灌胃 1 次,连续灌胃 30 d15。1.3.5.2 力竭游泳时间 通过负重游泳试验,记录各组动物的力竭游泳时间,观察不同动物的运动耐力,具体为末次灌胃结束后 30 min,各组随机选择 10 只小鼠,于鼠尾绑系 5%重物后,置于水箱内,记录每只小鼠自入水游泳至头部沉没 5 s后的时
20、间,作为动物的力竭游泳时间16。1.3.5.3 相关生化指标检测 末次灌胃结束后,将各组剩余小鼠置于水箱内游泳 30 min 后,取出擦净身体,眼眶摘取眼球采血,离心(3500 r/min、10 min)取血清,测定 LA 与 BUN 的含量。采血后的小鼠处死后,摘取肝脏和腓肠肌,经冰生理盐水漂洗,粉碎匀浆后离心(3500 r/min、10 min)后,分别按照相应试剂盒使用要求,测定 LG、MG 含量与 GSH-Px、SOD 活力17。1.4 数据处理所有结果均以平均值 标准差(平行测定 5次)表示,另采用 SPSS 19.0 软件对组间结果进行方差分析,以 P0.05 表示具有显著性差异,
21、P0.01 表示具有极显著性差异。692023年第9期中国食品添加剂China Food Additives试验研究2 结果与分析2.1 大孔树脂的静态吸附-解吸性能大孔树脂的材料、粒径及孔径均会影响目标物的分离,因此考察不同型号大孔树脂对白茅根黄酮化合物的静态吸附与解吸效果,结果见表 1。从表 1 可见,六种大孔树脂对白茅根黄酮化合物的吸附率大小排序为 XAD-16 D101 AB-8 X-5 HPD-100 HPD-400,解吸率大小排 序 为 HPD-400 HPD-100 AB-8 X-5 D101 XAD-16,虽然 XAD-16 和 D101 树脂的吸附率较高,HPD-400 与
22、HPD-100 的解吸率较高,但 AB-8 树脂对目标物的回收率最佳。白茅根黄酮类物质的主要成分为麦黄酮、六羟黄酮-3,6,3-三甲基醚、六羟黄酮-3,5,6,3-四甲基醚、3,5-二氧-甲基山奈酚及 5-羟基-2-苯乙基色原酮及 5-2-2-(2-羟基苯基)乙基色原酮等化合物,结构中非极性基团较多,根据相似相溶原理,易被极性较弱的树脂所吸附,又由于树脂的孔径较小时,比面积较大,对目标物的吸附作用较强18,XAD-16 大孔树脂平均孔径为 0.5 mm0.7 mm,因而对白茅根黄酮的吸附率最大,但结合作用力过强,不利于后续洗脱操作,AB-8 大孔树脂预处理操作简便、成本较低,常作为黄酮类物质的
23、纯化树 脂19,考虑回收率结果,选择该型号树脂作为后续研究用纯化介质。表 1 不同类型的大孔树脂对白茅根黄酮的静态吸附与解吸效果Table 1 Effect of different macroporous resins on Rhizoma imperatae flavonoids static adsorption-desorption 大孔树脂极性吸附率/%解吸率/%回收率/%D101非极性 82.9 0.5b74.7 0.4e61.9 0.5bAB-8弱极性 80.5 0.5c82.6 0.7c66.5 0.6aHPD-100非极性 71.2 0.6e 84.3 0.4b60.0 0.
24、5cHPD-400中极性 66.8 0.5f88.7 0.4a59.3 0.4cX-5非极性 76.4 0.4d77.4 0.6d59.1 0.5cXAD-16非极性 86.7 0.6a70.5 0.5f61.1 0.5b注:同一列不同字母表示差异显著(P0.05)。2.2 上样液质量浓度对吸附率的影响图 1 为上样液质量浓度对 AB-8 大孔树脂吸附白茅根黄酮化合物的影响。随着上样液浓度的增大,AB-8 大孔树脂对白茅根黄酮的吸附率逐渐减小。上样液浓度过高,单位表面积的大孔树脂接触量越大,使得传质速度减慢,树脂吸附越容易趋于饱和,但上样液浓度过低,树脂的吸附效率偏低。从图 1 可见,当上样液
25、浓度超过 2.0 mg/mL 后,树脂的吸附率明显下降,为此选择上样液质量浓度为 2.0 mg/mL。1.02.03.0上样液浓度/(mg/mL)吸附率/%4.05.060556570758085图 1 上样液质量浓度对吸附率的影响Figure 1 Effect of loading solution mass concentration on the adsorption rate2.3 上样液 pH 对吸附率的影响图 2 为上样液 pH 对 AB-8 大孔树脂吸附白茅根黄酮化合物的影响。随着上样液 pH 的增大,树脂对白茅根黄酮化合物的吸附率呈先增大后减小的趋势,当上样液 pH 为 5.0
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