白念珠菌 HGT 19基因敲除株的构建与基因功能初步研究.pdf
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1、 ,()中 国 人 兽 共 患 病 学 报C h i n e s eJ o u r n a l o fZ o o n o s e sD O I:/j i s s n 实验研究白念珠菌H G T 基因敲除株的构建与基因功能初步研究陈婷,黄孝天,张陆兵通讯作者:张陆兵,E m a i l:q q c o m;O R C I D:作者单位:江西省职业病防治研究院,南昌 ;南昌大学医学部微生物学教研室,南昌 摘要:目的构建白念珠菌HG T 基因敲除株,并进行初步的基因功能研究.方法利用同源重组的原理,采用L E U、H I S和A R G营养筛选策略,选用乙酸锂法转化白念珠菌,同时替换白念珠菌原基因组
2、的两条链,得到HG T 敲除菌(HG T /).利用敲除菌与野生型对照开展一系列表型研究,初步探索HG T 在白念珠菌中的功能.结果经过P C R和营养型鉴定,成功获得HG T 敲除株.点板实验表明HG T /与野生型相比,HG T /对Z n与细胞膜损伤剂S D S(十二烷基硫酸钠)敏感,对其他大部分金属离子(N a、K、L i、C a、F e、F e、C u)无明显差异.生物膜实验表明HG T /生物膜与野生型相比有缺陷.小鼠的生存实验表明,HG T /组与野生型组相比,可减缓小鼠的死亡.结论敲除HG T 基因后,白念珠菌对锌离子敏感,形成生物膜能力明显减弱,毒力明显减弱.关键词:白念珠菌
3、;基因敲除;生物被膜;锌离子;毒力中图分类号:R 文献标识码:A文章编号:()C o n s t r u c t i o no fa nH G T g e n ed e f i c i e n tC a n d i d aa l b i c a n ss t r a i na n dp r e l i m i n a r ya s s e s s m e n t o f g e n e f u n c t i o nCHE NT i n g,HUANGX i a o t i a n,Z HANGL u b i n g(J i a n g x i I n s t i t u t eo fO c
4、c u p a t i o n a lD i s e a s eP r e v e n t i o n,N a n c h a n g ,C h i n a;D e p a r t m e n t o fM e d i c a lM i c r o b i o l o g y,M e d i c a lC o l l e g e,N a n c h a n gU n i v e r s i t y,N a n c h a n g ,C h i n a)A b s t r a c t:T h i ss t u d yw a sa i m e da t c o n s t r u c t i n
5、ga nHG T g e n ek n o c k o u t s t r a i no fC a n d i d aa l b i c a n sa n dc o n d u c t i n gp r e l i m i n a r yg e n e f u n c t i o ns t u d i e s B a s e do nh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n,L E U,H I S a n dA R G n u t r i t i o n a l s c r e e n i n gs t r a t e g i e s,a n d
6、t h e l i t h i u ma c e t a t em e t h o dw e r eu s e d t o t r a n s f o r mC a n d i d aa l b i c a n s T h e t w oc h a i n so fC a n d i d a a l b i c a n sg e n o g e n i cg e n o m ew e r er e p l a c e dt oo b t a i nt h eHG T k n o c k o u t s t r a i n(HG T /)T op r e l i m i n a r i l ye
7、 x p l o r e t h e f u n c t i o no fHG T i nC a n d i d aa l b i c a n s,w ep e r f o r m e das e r i e so f p h e n o t y p i c s t u d i e su s i n g t h ek n o c k o u t s t r a i na n daw i l d t y p e c o n t r o l T h eHG T k n o c k o u t s t r a i nw a ss u c c e s s f u l l yo b t a i n e
8、d,b a s e do nP C Ra n dv e g e t a t i v et y p e i d e n t i f i c a t i o n C o m p a r e dw i t hw i l dt y p e,HG T /w a ss e n s i t i v e t oZ na n dS o d i u md o d e c y l s u l f a t e,b u tn o t t om o s to t h e rm e t a l i o n s(N a,K,L i,C a,F e,F e,C u)B i o f i l me x p e r i m e n
9、t s s h o w e d t h a tHG T /b i o f i l m sw e r ed e f e c t i v e,i nc o n t r a s t t ow i l d t y p eb i o f i l m s S u r v i v a l e x p e r i m e n t s i nm i c ed e m o n s t r a t e dt h a t t h eHG T /g r o u p,c o m p a r e dw i t ht h ew i l dt y p eg r o u p,s h o w e ds l o w e dd e a
10、 t h C o m p a r e dw i t ht h ew i l dt y p e,t h eHG T g e n ek n o c k o u t s t r a i nw a s s e n s i t i v e t o z i n c i o n s,a n d i t sb i o f i l mf o r m a t i o na b i l i t ya n dv i r u l e n c ew e r e s i g n i f i c a n t l yw e a k e r K e y w o r d s:C a n d i d aa l b i c a n s
11、;g e n ek n o c k o u t;b i o f i l m;z i n c i o n;t o x i c i t yC o r r e s p o n d i n ga u t h o r:Z h a n gL u b i n g,E m a i l:q q c o m白念珠菌是隶属于子囊菌门的一种条件致病菌,持续定植在口腔,胃肠道和泌尿生殖系统.对于健康正常宿主而言,通常情况下白念珠菌与其他正常菌群处于共生状态,在体内可以保持平衡,但在宿主体内金属离子代谢改变时转变为病原体.多种毒力属性的表达促进了白念珠菌形态的转换,导致多种感染,从浅表粘膜到系统性念珠菌病.虽然浅表感染非
12、常常见且可以治疗,但血液感染仍危及生命,据报道死亡率为.更令人担忧的是,耐多药真菌物种的出现,因此迫切需求开发新的治疗药物,针对未开发的真菌途径,例如微营养免疫.微营养免疫是指在微生物感染期间,宿主隔离铁、锌和其他金属营养素,从而抑制病原体的生长,它是宿主对多种微生物病原体反应的一个重要特征.一项最新结果表明,白念珠菌在播散性感染时受铁、锌营养免疫的影响,而在口腔感染时不受铁营养免疫的影响.这也说明营养免疫中金属离子稳态的调节是相当复杂的.人体细胞中的铁外泵蛋白属于主要协同转运蛋白超家族(m a j o r f a c i l i t a t o r s u p e r f a m i l y
13、,MF S)家族,目前在白念珠菌中没有相关铁泵蛋白的报道,所以我们聚焦在白念珠菌中是否有铁泵蛋白的存在,通过在数据库中蛋白的功能描述及相关文献的报道,发现了几个基因的蛋白受白念珠菌铁稳态有关的核心转录因子(S e f,S f u,HA P)调节,所以我们着重关注了几个基因,分别对其编码基因进行了敲除.在这几个基因研究中我们发现了一个HG T 基因可能涉及到锌离子的代谢,后续做了一系列的其他金属离子点板实验、细胞膜损伤剂点板实验、菌丝诱导实验、小鼠毒力实验等,为后续研究HG T 基因的功能奠定了基础,也为研发新型的靶向药物提供了思路.材料与方法菌株和质粒白念珠菌S N (h i s/h i s,
14、a r g/a r g,l e u/l e u,u r a/U R A,i r o/I R O),为同源重组基因敲除亲本菌株,中国科学院生物化学与细胞生物学研究所陈江野教授惠赠.白念珠菌S N (l e u:C mL E U/l e u:C dH I S,h i s/h i s,a r g/a r g,l e u/l e uu r a/U R A,i r o/I R O),来源于白念珠菌S N ,与基因敲除株营养型相同,可作为基因敲除株野生型对照的菌株,中国科学院上海巴斯德研究所陈昌 斌 研 究 员 惠 赠.白 念 珠 菌HG T(HG T:C mL E U/HG T,h i s/h i s,
15、a r g/a r g,l e u/l e u,u r a/U R A,i r o/I R O),为HG T 单条等位基因敲除株,本研究构建;白念珠菌HG T/(HG T:C mL E U/HG T:C dH I S,h i s/h i s,a r g/a r g,l e u/l e u,u r a/U R A,i r o/I R O),为HG T 基因双条等位基因敲除株,本研究构建.p S N 和p S N 分别携带C mL E U和C dH I S编码基因,中国科学院生物化学与细胞生物学研究所陈江野教授惠赠.实验动物周B A L B/c小鼠(雌鼠).培养基Y P D培养基(酵母提取物,蛋白
16、胨,葡萄糖,固体培养基另外添加琼脂粉),S D培养基(无氨基酵母氮源,硫酸铵,其他所需氨基酸,葡萄糖,固体培养基另外添加琼脂粉),P B S缓冲液(氯化钠,氯化钾,磷酸氢二钠,磷酸二氢钾).主要试剂和仪器P h a n t aM a x高保真D NA聚合酶反应试剂购自中国V a z y m e,P C R产物凝胶回收试剂,P C R仪,恒温培养箱等.实验步骤基因敲除株的构建首先是设计引物,引物序列见表,利用设计的引物融合所需的基因片段.然后利用醋酸锂转化法将获得的融合基因片段依次转入S N 中,替换原基因组中的HG T 基因,构建示意图见图.接着对转化成功的菌株进行营养型鉴定,最后用酸化玻璃微
17、珠法提取阳性克隆株基因组,利用设计的验证引物进行P C R,验证目的基因与营养标记基因的插入位点,琼脂糖凝胶电泳鉴定长度.表实验所用引物及序列T a b P r i m e r sa n ds e q u e n c e su s e d i nt h e e x p e r i m e n t引物名称引物序列()上游验证引物(u p c h e c k)C T AG G AA C T T G T AG GA G AA C G C T上游同源臂正向扩增(u p F)A C A C C A GA G C A T TA C G A G G C上游同源臂反向扩增(u p R)C A C G G C
18、G C G C C T AG C AG C G G T G C AA T G C G T T T G G T G G AA G目的基因验证正向(HG T t c F)AAG A GAAG G AG G C G AA C A T G G目的基因验证反向(HG T t c R)AA T G A C C G AG C AG C A C AAG T下游同源臂正向扩增(d o w n F)G T C A G C G G C C G C A T C C C T G C A T T C G A T C G A C C A C C A C G AG下游同源臂反向扩增(d o w n R)A G C C AA
19、C A GA G A C G G T T GA G下游验证引物(d o w n c h e c k)C T C C AA TA C T G C G T C G C C A TL E UL E F T(c h e c k)C A T T C A C A C AA C C T G G G T A T T GL E UR I GHT(c h e c k)C T C T C A C C G G T T TA C T T G GA T C中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ,()表(续)引物名称引物序列()H I SL E F T(c h e c k)G T G G C A C A T T T C A
20、C A C C C AGH I SR I GHT(c h e c k)G A T G T T G T G T AAAA T G C T G C GP r i m e r(F)G C AG G GA T G C G G C C G C T GA C G C C A G T G T GA T G G A T A T C T G CP r i m e r(R)C C G C T G C T AG G C G C G C C G T G A G C T C G GA T C C A C T AG T AA C G图P C R介导的同源重组基因敲除策略示意图F i g S c h e m a t i c
21、d i a g r a mo fP C R m e d i a t e dh o m o l o g o u s r e c o m b i n a n t g e n ek n o c k o u t s t r a t e g y点板实验首先配置添加不同物质以及不添加这些物质的Y P D固体培养基.然后分别挑取野生型菌株和HG T 基因敲除株的单克隆菌落于m L新鲜Y P D液体培养基 r/m i n摇床过夜培养约 h收菌,用磷酸盐缓冲液(P B S)配置 C F U/m L C F U/m L个浓度梯度的菌液,吸取L各浓度的菌液,均匀的点在相应的固体培养基表面.最后将平板放置于培养箱孵育
22、 h后观察生长情况.结晶紫法生物膜形成实验挑取野生型菌株和HG T 基因敲除株单克隆菌落于m L新鲜Y P D液体培养基中,放置于 恒温摇床内 r/m i n摇床过夜培养约 h收菌,用S p i d e r液体培养基(菌丝诱导培养基)配置适量O D 的菌 液.然 后 将 该 菌 液 加 入 十 二 孔 板 中,每 孔m L,每个菌设个空白孔,再将十二孔板放置于 恒温摇床内,r/m i n孵育.m i n后,取出十二孔板吸弃菌液,用P B S洗涤后加入m L新鲜的S p i d e r液体培养基再继续放置于前述条件下孵育.h后,取出十二孔板吸弃孔内菌液,先用P B S洗去未附着的菌体和杂志,然后
23、用甲醇固定 m i n,再用结晶紫染色 m i n,接着用冰醋酸脱色 m i n.最后,用酶标仪测定脱色液O D 吸光度值.使用G r a p h P a dP r i s m绘制统计图,并进行数据分析.固体菌丝诱导实验挑取野生型菌株和HG T 基因敲除株单克隆菌落于 m L新鲜的Y P D液体培养基中,放置于 恒温摇床内 r/m i n过夜培养 h.然后用P B S将菌液稀释至O D ,按 倍梯 度 稀 释次,取LO D 的菌液在S p i d e r固体培养基上进行点板,最后将培养基放置于 恒温培养箱孵育d,定期进行观察并拍照.小鼠的毒力实验先挑选 只周的B A L B/c小鼠,体重在 g
24、,分为两组.接着用牛鲍氏计数板计算野生型菌株和HG T 基因敲除株对数生长期的菌液浓度.然后,每只小鼠接种的菌量为 C F U/m L,尾静脉注射.接种后每天观察小鼠的生存状态、饮食饮水情况及体重变化并记录.最后,用G r a p h P a dP r i s m绘制生存曲线,秩和检验比较组间差异,P 为差异有统计学意义.结果白念珠菌HG T 基因敲除株构建营养型鉴定白念珠菌S N 为基因敲除株的亲本菌,其在营养缺陷的S D培养基上是无法生长的,转化成功的基因敲除菌由于携带了相应的期陈婷,等:白念珠菌HG T 基因敲除株的构建与基因功能初步研究氨基酸标记可以在其对应的缺陷培养基上生长.所以将白
25、念珠菌S N 、S N 、和HG T /分别连续划线接种于Y P D、S D/L E U和S D/L E U H I S固体培养基进行各菌株的营养型鉴定.结果显示,野生 型 菌 株S N 在Y P D、S D/L E U和S D/L E U H I S固体培养基上均能生长;亲本菌S N 在Y P D固体培养基可以生长,在两种S D固体培养基上均不能生长;HG T 基因双缺株HG T /在Y P D、S D/L E U和S D/L E U H I S固体培养基上均可以生长.如图所示,营养型鉴定结果均符合预期.图白念珠菌H G T 和H G T /的营养型鉴定F i g N u t r i t i
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