博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织铁死亡相关基因表达谱分析.pdf
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1、论 著Med J Chin PLA,Vol.48,No.10,October 28,2023基础研究博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织铁死亡相关基因表达谱分析沈忱悠1,聂晓伟2,卫栋3,杨旭生1,江成1,王伟1,盛雅婷1,李桂荣1*,陈静瑜3*1南京医科大学附属无锡市人民医院移植实验室,江苏无锡 214023;2深圳市人民医院呼吸疾病研究所,广东深圳 518020;3南京医科大学附属无锡市人民医院移植中心,江苏无锡 214023中图分类号 R563 文献标志码 A DOI 10.11855/j.issn.0577-7402.1053.2023.0222声明 本文所有作者声明无利益冲突引用本文 沈
2、忱悠,聂晓伟,卫栋,等.博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织铁死亡相关基因表达谱分析J.解放军医学杂志,2023,48(10):1135-1143.收稿日期 2022-05-07 录用日期 2022-07-16 上线日期 2023-02-22摘要 目的分析博来霉素诱导的肺纤维化模型小鼠肺组织铁死亡相关基因的表达谱并探讨其可能的作用机制。方法取12只67周龄雄性C57BL/6小鼠,随机分为模型组与对照组,每组6只,分别构建肺纤维化模型及进行对照处理。3周后处死小鼠,采用HE与Masson染色评估其肺部病理改变和胶原纤维堆积状况,普鲁士蓝染色观察肺组织铁聚集水平。应用小鼠铁死亡通路PCR Array筛
3、选差异表达基因,采用生物信息学分析方法对差异基因进行GO功能富集与KEGG信号通路预测。运用实时定量PCR验证模型组与对照组肺组织铁死亡相关差异基因的表达水平。结果与对照组比较,模型组小鼠肺组织出现纤维化改变及明显的铁沉积。PCR Array检测结果显示,与对照组比较,模型组碳酸酐酶9(CA9)、半胱氨酰-tRNA合成酶1(CARS1)、热休克转录因子(HSF1)、NADPH氧化酶3(NOX3)、线粒体铁蛋白(FTMT)等5个铁死亡相关基因的表达量明显降低(P0.05)。GO功能富集分析与KEGG信号通路预测结果显示,肺纤维化模型小鼠肺组织的差异表达基因主要与体温内稳态、NADPH氧化酶复合体
4、、碳酸脱氢酶活性等功能有关,并在氮素代谢、氨酰合成、军团菌病等通路中富集。实时定量PCR验证结果显示,模型组小鼠肺组织中CA9、CARS1、HSF1及FTMT的表达量均明显低于对照组(P0.05)。结论博来霉素诱导的肺纤维化模型小鼠肺组织中多个铁死亡相关基因的表达水平发生明显变化,提示铁死亡在特发性肺纤维化中发挥重要作用,其中的差异基因或可为临床治疗提供潜在靶点。关键词 肺纤维化;铁死亡;PCR列阵;生物信息学Expression profile of genes related to ferroptosis in a murine model of pulmonary fibrosis in
5、duced by bleomycinShen Chen-You1,Nie Xiao-Wei2,Wei Dong3,Yang Xu-Sheng1,Jiang Cheng1,Wang Wei1,Sheng Ya-Ting1,Li Gui-Rong1*,Chen Jing-Yu3*1Laboratory of Human Organ Transplantation,3Transplant Center,Wuxi Peoples Hospital of Nanjing Medical University,Wuxi,Jiangsu 214023,China2Shenzhen Institute of
6、Respiratory Diseases,Shenzhen Peoples Hospital,Shenzhen,Guangdong 518020,China*Corresponding author.Chen Jing-Yu,E-mail:;Li Gui-Rong,E-mail:This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(82070059),and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province(BK20190150)Abstract
7、 ObjectiveTo study the expression profile and possible roles of ferroptosis-related genes in a bleomycin-induced murine model of pulmonary fibrosis.MethodsTwelve 6-7-week-old male C57BL/6 mice were randomly divided into model group and control group,6 in each group.The model group received nasal inh
8、alation of bleomycin,while the control group was given an equal volume 基金项目 国家自然科学基金(82070059);江苏省自然科学基金(BK20190150)作者简介 沈忱悠,医学博士,主要从事肺纤维化发病机制方面的研究通信作者 陈静瑜,E-mail:;李桂荣,E-mail:1135解放军医学杂志 2023年10月28日 第48卷 第10期of normal saline.Lung tissues were collected 3 weeks after modeling.Pathological changes and
9、 collagen deposition in lungs were observed by HE and Masson staining.Prussian blue staining was used to observe the level of iron accumulation in lung tissue.Total RNA was extracted for PCR Array to identify ferroptosis-related differentially expressed genes(DEGs).Functional analysis for DEGs was p
10、erformed by Gene Ontology(GO)and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway analysis.Expression levels of DEGs were verified by RT-qPCR analysis.ResultsCompared with control group,fibrosis and obvious iron deposition occured in mouse lung tissue of model group.The PCR array identified five
11、 ferroptosis-related genes that expression significantly decreased in model group compared with control group including carbonic anhydrase 9(CA9),cysteinyl-tRNA synthetase 1(CARS1),heat shock transcription factor 1(HSF1),NADPH oxidase 3(NOX3)and mitochondrial ferritin(FTMT)(P0.05).GO functional enri
12、chment analysis and KEGG pathway analysis showed that the DEGs were mainly related to temperature homeostasis,NADPH oxidase complex,and carbonate dehydratase activity,and were involved in nitrogen metabolism,aminoacyl-tRNA biosynthesis and legionellosis signaling pathways.RT-qPCR verification confir
13、med that the expression levels of CA9,CARS1,HSF1 and FTMT were significantly decreased in model group than those in control group(P0.05).ConclusionsChange of the expression of genes related to ferroptosis has been confirmed in a murine model of pulmonary fibrosis induced by bleomycin.The result indi
14、cates that ferroptosis is involved in the process of idiopathic pulmonary fibrosis,ferroptosis-associated DEGs might provide potential targets for clinical treatment of it.Key words pulmonary fibrosis;ferroptosis;PCR Array;bioinformatics特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种威胁生命的肺部疾病1,其病死率超过多
15、种肿瘤,发病群体主要为老年人2。IPF的危险因素主要包括年龄、吸烟及环境污染等3。在早期研究中,炎症被认为是IPF的主要发病机制,因此,类固醇疗法曾长期被用于IPF的治疗。近期研究显示,肺泡细胞的反复损伤与异常修复导致肺间质纤维化沉积的理论,可更为合理地阐释IPF的发病机制4。抗纤维化药物尼达尼布与吡非尼酮由于可延缓疾病进程5,已获批应用于IPF的临床治疗。然而,除肺移植外,目前仍然缺乏治愈IPF的有效措施6-7。铁死亡是近年发现的可调控性细胞死亡8-9,与凋亡、坏死、自噬等形式的细胞死亡不同,其主要特征为铁依赖的危害性脂质活性氧积聚10-11。越来越多的证据显示,铁死亡与包括肺纤维化在内的多
16、种肺部疾病密切相关。例如,铁代谢通路中的重要分子谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPx4)表达缺陷型小鼠对博来霉素诱导的肺纤维化更为易感;而在采用GPx4过表达小鼠构建的IPF模型中,肺纤维化程度明显减轻12。关于铁死亡与IPF的多数文献报道,仅明确肺纤维化中存在铁死亡这一现象,其相关机制仍有待进一步阐明。本研究采用博来霉素诱导建立肺纤维化小鼠模型,运用PCR Array技术筛选该模型中与铁代谢相关的差异表达基因,探讨铁死亡在IPF发生中可能的作用机制。1材料与方法1.1主要试剂及仪器博来霉素购自日本化药株式会社;4%多聚甲醛固定液、琼脂糖、HE染色试剂
17、盒购自上海碧云天生物技术有限公司;Masson染色试剂盒购自南京建成生物工程研究所;普鲁士蓝染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;Trizol试剂购自美国Sigma公司;反转录试剂盒、定量PCR试剂盒和小鼠铁死亡相关基因PCR Array plate试剂盒购自上海沃吉基因科技有限公司。PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。石蜡包埋机购自常州派斯杰医疗设备有限公司;病理切片机(型号RM2235)购自德国Leica公司;核酸凝胶电泳系统购自上海天能科技有限公司;超微量紫外分光光度计(型号NanoDrop 2000C)购自美国Thermo公司;光学显微镜购自日本奥林巴斯公司;实时荧光定量PC
18、R仪(型号ABI7500)购自美国ABI公司。1.2实验动物及分组67周龄的SPF级健康雄性C57BL/6小鼠12只,体重2025 g,购自常州卡文斯实验动物有限公司实验动物生产许可证编号:SCXK(苏)2016-0010。小鼠饲养于屏障环境下、通风良好的南京医科大学附属无锡市人民医院动物实验中心小鼠房内,可自由饮水、进食;饲养环境温度与湿度适宜,照明12 h、黑暗12 h交替进行。适应性喂养一周后,将小鼠随机分为对照组和模型组,每组6只。所有动物护理与实验均符合南京医科大学实验动物福利伦理管理委员会规范,全部操作及处理均遵循美国国立卫生研究院出版的实验动物护理和使用指南。1.3肺纤维化小鼠模
19、型的制备参照文献13的方法构建博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥(45 mg/kg)麻醉满意后,左手揪住其颈部皮肤,使其仰卧于手心,小指夹住尾巴固定小鼠,使用微量移液器通过鼻腔给药方式对模型组小鼠给予5 mg/kg的博来霉素,对照组给予等量生理盐水。给药3周后,使用1%戊巴比妥(100 mg/kg)过量麻醉对两组小鼠实施安乐死,收集其肺组织。根据解剖学特征将小鼠肺组织分为五叶,取其中一叶用于组织病理学染色,以评估肺纤维化模型构建1136Med J Chin PLA,Vol.48,No.10,October 28,2023是否成功,剩余肺组织存放于-80超低温冰箱,用于后续
20、差异基因筛选分析等操作。1.4小鼠肺组织切片染色将新鲜取下的小鼠肺组织浸没于 4%多聚甲醛液中固定 24 h,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋。包好的蜡块以5 m厚度切片,后续用于HE染色、Masson染色及普鲁士蓝染色,具体操作步骤按相应试剂盒说明书进行。封片后置于光学显微镜下观察,HE染色切片胞质被染成粉红色或红色,胞核呈蓝色;Masson染色切片胞质与肌纤维被染成红色,胶原纤维呈蓝色;普鲁士蓝染色切片胞质含铁血黄素或三价铁时被染成蓝色,细胞核被染成红色,其余呈浅红色或不着色。1.5PCR Array检测小鼠肺组织铁死亡相关基因的mRNA表达每组随机选取3只小鼠,Trizol法提取肺组
21、织总RNA。使用RNA凝胶电泳评估其质量,超微量紫外分光光度仪检测其纯度与浓度。对质检合格的RNA进行反转录以合成cDNA模板,将获得的cDNA与qPCR预混液按说明书比例混合,以9 l/孔的用量精准加入Ferroptosis PCR Array Plate(mouse)反应板各孔内,根据反应推荐程序对样品进行实时荧光定量PCR测定。1.6筛选和分析小鼠肺组织铁死亡相关的差异表达基因对于PCR Array检测获得的数据,采用2-Ct法计算倍数变化值(fold change,FC),以上调或下调倍数变化值FC2且P0.05作为差异基因的筛选阈值。应用R语言程序包clusterProfiler(4
22、.2.2)对筛选获得的差异基因进行基因本体(gene ontology,GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路预测,其中GO分析涵盖了生物学中的生物过程、细胞组分和分子功能三个方面。1.7实时荧光定量PCR验证小鼠肺组织铁死亡相关差异基因的表达使用Trizol试剂提取对照组与模型组小鼠肺组织总RNA,利用反转录试剂盒将其反转录为cDNA,采用定量PCR试剂盒对合成的cDNA模板进行实时荧光定量PCR扩增,以-actin为内参基因,以2-Ct法计算mRNA的相对表达量。引物序列见表1。1.8小鼠
23、肺组织铁死亡相关差异基因在临床样本中的表达验证通过美国国立生物技术信息中心创建并 维 护 的 基 因 表 达 综 合 数 据 库(gene expression omnibus,GEO,https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo),在“GEO Profiles”检索模式下分别以各差异基因名称与“idiopathic pulmonary fibrosis”作为关键词检索相关数据集,选取以正常对照与IPF患者肺组织样品为基础的高通量芯片数据集,分析各差异基因在相应数据集的表达情况。1.9统计学处理采用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。计量资料符合正态分布时以x
24、s表示,两组间比较采用成组样本t检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1小鼠肺纤维化模型的建立HE染色结果显示,对照组小鼠肺内结构清晰、肺泡间隔正常,无明显的炎症细胞浸润或纤维化形成;模型组小鼠肺部出现肺泡结构大面积破坏,肺泡腔萎缩消失,出现明显的肺间质纤维化及大量炎性细胞浸润。Masson染色结果显示,对照组小鼠肺泡结构正常、蓝染区域较少且着色浅,未见明显的胶原沉积;与对照组比较,模型组小鼠肺泡结构完全丢失,胶原纤维所对应的蓝染区域明显增加、着色加深,且部分肺泡被胶原覆盖(图1)。2.2两组小鼠肺组织铁沉积情况普鲁士蓝染色结果显示,对照组小鼠肺泡结构清晰,肺泡腔与间隔内未见明显的蓝色
25、颗粒,铁染色结果为阴性;与对照组比较,模型组小鼠肺组织结构紊乱,肺间质内出 现 一 定 数 量 的 蓝 染 颗 粒,铁 染 色 结 果 呈 阳性(图2)。2.3两组小鼠肺组织铁死亡相关基因表达谱分别提取两组小鼠肺组织RNA,反转录后行PCR Array检测,将上调或下调倍数变化值FC2且P0.05作为筛选条件对结果进行分析。热图可体现样本与差异表达基因的聚类分布情况。本次Array所检测的90个铁死亡相关基因中,红框标注的5个基因在对照组与模型组中各自积聚到一个集中区域(图3)。利用火表1实时荧光定量PCR引物序列Tab.1Primer sequences for real-time fluo
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