白花前胡CAL基因的克隆和原核表达分析.pdf
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1、Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med白花前胡CAL基因的克隆和原核表达分析管凤雅1,吴君贤1,姚金辰1,查良平1,储姗姗1*,谢晋2*1.安徽中医药大学 药学院,安徽 合肥 230012;2.安徽医科大学 药学院,安徽 合肥 230032摘要 目的:克隆得到白花前胡花发育关键基因 CAULIFLOWER(CAL)并对其进行原核表达和基因表达分析。方法:根据白花前胡转录组数据中的基因序列信息,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从白花前胡中克隆CAL 基因,命名为 PpCAL1 和 PpCAL2。构建原核表
2、达载体 pET-32a-PpCAL1 和 pET-32a-PpCAL2,并转化至大肠埃希菌 Transetta(DE3)进行诱导表达。运用实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)分析抽薹开花前后白花前胡不同组织的基因相对表达量。结果:PpCAL1 和 PpCAL2 的开放阅读框(ORF)长度分别为 645、738 bp,分别编码 214、245个氨基酸。结构功能域分析表明,PpCAL1 和 PpCAL2 蛋白都具有 MADS_MEF2_like 和 K-box 保守结构域。原核表达结果显示,异丙基-D-硫代半乳糖苷可成功诱导目的蛋白表达。系统进化树分析显示,白花前胡 PpCAL1 与胡萝卜 Dc
3、CAL 聚为一支,白花前胡 PpCAL2 与橡胶树 HbCAL 聚为一支。基因表达结果显示,PpCAL1 和 PpCAL2 在不同组织中均在开花后表达量上调。结论:克隆并分析白花前胡 PpCAL1 和 PpCAL2 基因,为进一步研究白花前胡开花基因提供参考。关键词 白花前胡;CAL基因;抽薹开花;基因克隆;原核表达中图分类号 R282.12 文献标识码 A 文章编号 1673-4890(2023)08-1723-07 doi:10.13313/j.issn.16734890.20230220003Gene Cloning and Prokaryotic Expression Analysis
4、 for CAL Gene from Peucedanum praeruptorum DunnGUAN Feng-ya1,WU Jun-xian1,YAO Jin-chen1,ZHA Liang-ping1,CHU Shan-shan1*,XIE Jin2*1.School of Pharmacy,Anhui University of Chinese Medicine,Hefei 230012,China;2.School of Pharmacy,Anhui Medical University,Hefei 230032,ChinaAbstract Objective:In this stu
5、dy,the key genes in flower development in Peucedanum praeruptorum Dunn were cloned.Meanwhile,prokaryotic expression and gene expression analysis were carried out.Method:According to the gene sequence information from the P.praeruptorum transcriptome data,genes encoding CAULIFLOWER(CAL)were cloned fr
6、om P.praeruptorum by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR),named PpCAL1 and PpCAL2,respectively.Prokaryotic expression vectors pET-32a-PpCAL1 and pET-32a-PpCAL2 were transformed into Escherichia coli Transetta(DE3)for induction.A real-time quantitative PCR(qRT-PCR)analysis was perf
7、ormed to profile the expression in different tissue of both non-bolting and bolting plants.Result:The open reading frame(ORF)lengths of PpCAL1 and PpCAL2 were 645 and 738 bp,encoding 214 and 245 amino acids.Structural functional domain analysis showed that PpCAL1 and PpCAL2 contained conserved MADS_
8、MEF2_like and K-box domains.Prokaryotic expression results showed that IPTG induction could successfully induce the expression of the target protein.Phylogenetic tree analysis showed that PpCAL1 and DcCAL were clustered into a branch,and PpCAL2 and HbCAL were clustered into a branch.The expression l
9、evels of PpCAL1 and PpCAL2 in the different tissue of bolting plants were higher than those in non-bolting plants.Conclusion:The PpCAL1 and PpCAL2 genes of P.praeruptorum have been cloned and analyzed for the first time,and this study provides a reference for further research on the flowering genes
10、of P.praeruptorum.Keywords Peucedanum praeruptorum Dunn;CAULIFLOWER gene;bolting and flowering;gene cloning;prokaryotic expression 基础研究 基金项目 国家自然科学基金项目(81803675);安徽省自然科学基金项目(2208085QH269);安徽高校省级质量工程项目(2021jyxm0678)*通信作者 储姗姗,讲师,研究方向:中药资源及其质量评价;E-mail:谢晋,讲师,研究方向:中药资源及其质量评价;E-mail:1723Aug.2023 Vol.25 N
11、o.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med前胡为常见的中药材,来源于伞形科植物白花前胡 Peucedanum praeruptorum Dunn 的干燥根,具有散风清热、降气化痰的功效1。野生白花前胡资源主要分布于中国安徽、湖北、河南等地,生长于山坡疏林边、路旁灌丛或半阴性的山坡草丛中。野生前胡生长多年抽薹开花,而栽培前胡个体发育时间大大缩短,一般2年生就可抽薹开花2。抽薹开花前的前胡称为雌前胡,抽薹开花后根木质化,此时采收的前胡称为雄前胡3。前胡的质量可能与其雌雄株有关。古代本草均要求前胡在采收时“去雄”,历版中华人民共和国药典同样要求前胡应在其
12、未抽花茎时采挖4。有研究者通过实验得出抽薹后前胡的品质下降,雄前胡不适合药用的结论5。现今,在安徽宁国等前胡的产区,均将未抽薹开花的雌前胡作为药材的来源6。早薹已成为影响前胡质量的重要因素之一,研究抽薹开花的调控基因可为解决前胡质量问题提供参考。MADS-box基因编码的转录因子影响着植物的生长发育,其可以调控植物 MADS-box基因家族的不同成员,在植物生长过程中起着不可或缺的作用7。随着首个与花生长发育相关的 MADS-box基因从拟南芥中成功克隆,越来越多与花发育有关的基因得到了广泛的研究8。在拟南芥的发育过程中,维持花分生组织的活性是花器官原基产生的前提9,其主要是由 APETALA
13、1(AP1)和 CAULIFLOWER(CAL)促进和维持10,AP1和CAL均为MADS-box基因,在序列上高度同源。AP1在花分生组织、萼片和花瓣的形成中起主要作用;CAL调节AP111-13,影响花分生组织的形成,进一步调控花的生长发育14-15。目前,CAL已在花椰菜、甘蓝16等植物中被克隆,而白花前胡CAL基因的研究尚未见报道。本研究 通 过 克 隆 得 到 白 花 前 胡 开 花 基 因 PpCAL1 和PpCAL2的一段编码序列(CDS),对其进行相关生物信息学分析,构建了2个基因的原核表达载体并在大肠埃希菌中表达,分析其在不同生长发育时期和不同组织器官中的基因表达模式,为深入
14、研究开花基因在白花前胡生长发育过程中的作用提供依据。1材料白花前胡来源于安徽省宁国市胡乐镇“宁前胡”种植基地,经中国中医科学院中药资源中心彭华胜教 授 鉴 定 为 伞 形 科 植 物 白 花 前 胡 Peucedanum praeruptorum Dunn。经鉴定后收集未抽薹和已抽薹白花前胡的叶、根进行后续实验,所有组织样品液氮速冻后于80 冰箱中备用。Multifuge X1R 型 高 速 冷 冻 离 心 机(美 国Thermo Fisher 公司);ETC821 型聚合酶链式反应(PCR)仪(北京东胜创新生物科技有限公司);Mini-PROTEAN Tetra 型 电 泳 仪、CFX96
15、Optics Module型实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪(美国伯乐公司);DYCP-31DN型琼脂糖水平电泳仪(北京六一生物科技有限公司);Alphalmager HP型凝胶色谱成像仪(美国Protein Simple公司)。大肠埃希菌Trans1-T1感受态细胞、大肠埃希菌E.coli Transetta(DE3)感受态细胞、切胶回收试剂盒EasyPure Quick gel extraction kit、无缝拼接试剂盒pEASY Uni seamless cloning and assembly kit 均购于北京全式金生物技术有限公司;pET-32a载体购于武汉淼灵生物科技有限
16、公司;RNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司;反转录试剂盒PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit和T载体PMD18-T购自 TaKaRa公司;即用型磷酸盐缓冲液(PBS)片剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司;异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购于Sigma公司;2Realab Green PCR fast mixture 购自北京兰博利德商贸有限公司。2方法2.1总RNA提取与cDNA的合成提取白花前胡叶片总RNA,使用1%琼脂糖凝胶电泳验证其RNA完整性。使用反转录试剂盒进行反转录,得到白花前胡的cDNA。2.2PpCAL1和PpC
17、AL2基因的克隆白花前胡PpCAL1和PpCAL2基因来源于本实验室白花前胡转录组数据库 美国国家生物技术信息中心(NCBI)登录号为 PRJNA834850。根据转录组数据中的基因序列信息,以反转录后白花前胡叶片的cDNA为模板,分别对PpCAL1和PpCAL2基因开放阅读框(ORF)序列设计特异性引物,进行PCR扩增。上游引物为PpCAL1-F:5-ATGGGGAGAAA GAAAATAGAAATCA-3;PpCAL2-F:5-ATGGGT AGGGGTAGAGTACAGTTGA-3;下 游 引 物 为PpCAL1-R:5-CTATTGAAGCAACATAAGTGTTT 1724Aug.2
18、023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin MedGA-3,PpCAL2-R:5-TTATGAATTCATGTGTGAA AGCATC-3。PCR扩增产物进行电泳检测、切胶回收,将产物与克隆载体PMD18-T连接并测序。2.3PpCAL1和PpCAL2基因的生物信息学分析利用 NCBI ORF Finder(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找基因的 ORF;利用 ExPASy(https:/web.expasy.org/protparam/)预测基因编码蛋白理化性质;使用 CDD(ht
19、tps:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行蛋白质结构域分 析;使 用 TMHMM 2.0(https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)分析蛋白的跨膜结构域;利用在线工具 NPS(https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)进行蛋白质二级结构分析;利用SWISS-MODEL(http:/swissmodel.expasy.org/)结合PyMOL 2.2.0软件预测蛋白质的
20、三级结构;运用DNAMAN 6.0软件进行同源氨基酸序列比对;应用MEGA 6.0 软件构建 neighbor-joining 系统进化树,bootstrap重复次数为1000次。2.4PpCAL1 和 PpCAL2 基因的原核表达载体构建及表达根据克隆成功的PpCAL1和PpCAL2基因序列进行引物设计,上游引物为BamHI-PpCAL1-F:5-AG GCCATGGCTGATATCGGAATGGGGAGAAAGAAAATAGAAATCA-3;BamHI-PpCAL2-F:5-AGGCC ATGGCTGATATCGGAATGGGTAGGGGTAGAGTACAGTTGA-3;下游引物为 Bam
21、HI-PpCAL1-R:5-CGACGGAGCTCGAATTCGGACTATTGAAGCAACATAAGTGTTTGA-3;BamHI-PpCAL2-R:5-CGA CGGAGCTCGAATTCGGATTATGAATTCATGTGTGAAAGCATC-3(下划线表示以BamH作为酶切位点),进行PCR扩增,检测,切胶回收。同时对原核表达载体pET-32a质粒进行BamH酶切处理,切胶回收,将上述切胶回收产物用无缝拼接试剂盒进行拼接,连接产物转入感受态细胞大肠埃希菌Trans1-T1中,菌液PCR、测序分析正确后提取重组质粒,将重组质粒转化至表达感受态 Transetta(DE3)中,构建转化表
22、达宿主菌。取转化表达菌液接种至含有相对应抗生素的 LB 液体培养基 50 mL中,加入50%葡萄糖4 mL,37、200 r min1条件下振荡培养至菌液 600 nm 处吸光度(A)为 0.60.8时,取菌液1 mL 作为未诱导菌液,剩余菌液加 入 终 浓 度 为 0.4 mmolL1的 IPTG 于 16 、200 rmin1诱导 12 h,以同样条件处理pET-32a空载作为空白对照。取菌液1 mL于4、10 000g离心3 min弃上清液,加入PBS 1 mL清洗,清洗后再次离心,弃上清液,加入去离子水40 L,5十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液10
23、 L,混匀,获得全菌点样液;将剩余菌液以 5000g、4 离心 10 min,加入 PBS 35 mL重悬,重复1次后在冰浴条件下超声破碎10 min,离心,取上清液 40 L,加入 5SDS-PAGE 上样缓冲液 10 L,获得蛋白上清点样液。将上述点样液煮沸10 min后放置室温,进行SDS-PAGE电泳分析。2.5PpCAL1 和 PpCAL2 基因在雌前胡和雄前胡不同器官表达分析采用qRT-PCR对PpCAL1和PpCAL2基因在前胡抽薹开花前(叶、根)和抽薹开花后(叶、根)的表达模式进行分析。每个样品3株,分别提取RNA,TaKaRa试剂盒反转录获得 cDNA。以前胡 UBC9基因1
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