HPLC法同时测定湘莲中芦丁、金丝桃苷及槲皮素含量.pdf
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1、基金项目:湖南省自然科学基金项目(编号:)作者简介:钟菲菲,女,长沙市食品药品检验所工程师,硕士。通信作者:雷德卿(),男,长沙市食品药品检验所副主任药师,硕士。:收稿日期:改回日期:犇 犗 犐:犼 狊 狆 犼 狓 文章编号 ()法同时测定湘莲中芦丁、金丝桃苷及槲皮素含量 ,钟菲菲犣犎犗犖犌犉 犲 犻 犳 犲 犻李静犔 犐犑 犻 狀 犵雷德卿犔 犈 犐犇 犲 狇 犻 狀 犵杨韵犢 犃犖犌犢 狌 狀伍健芳犠犝犑 犻 犪 狀 犳 犪 狀 犵欧阳丽犗 犝 犢 犃犖犌犔 犻(长沙市食品药品检验所,湖南 长沙 )(犆 犺 犪 狀 犵 狊 犺 犪犐 狀 狊 狋 犻 狋 狌 狋 犲 犳 狅 狉犉 狅 狅 犱
2、犪 狀 犱犇 狉 狌 犵犆 狅 狀 狋 狉 狅 犾,犆 犺 犪 狀 犵 狊 犺 犪,犎 狌 狀 犪 狀 ,犆 犺 犻 狀 犪)摘要:目的:建立高效液相色谱法同时测定湘莲中芦丁、金丝桃苷及槲皮素的含量。方法:采用 色谱柱(,),以甲醇磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速 ,柱温,检测波长 。结果:批湘莲样品中芦丁、金丝桃苷 及槲 皮素 含 量 分 别 为 ,;芦丁、金丝桃苷和槲皮素检测质量浓度线性范围均为 (犚 ),在相应的线性范围内,种黄酮类物质线性关系好,灵敏度高,精密度、稳定性、重复性及回收率试验相对标准偏差()均小于;芦丁、金丝桃苷及槲皮素的平均加标回收率分别为,。结论:该方法操作便捷且结
3、果准确,可用于湘莲中黄酮类成分的含量测定和质量评价。关键词:湘莲;高效液相色谱;芦丁;金丝桃苷;槲皮素犃 犫 狊 狋 狉 犪 犮 狋:犗 犫 犼 犲 犮 狋 犻 狏 犲:,犕 犲 狋 犺 狅 犱 狊:(,)犚 犲 狊 狌 犾 狋 狊:,(犚 ),(),犆 狅 狀 犮 犾 狌 狊 犻 狅 狀:,犓 犲 狔 狑 狅 狉 犱 狊:;莲(犖 犲 犾 狌 犿 犫 狅狀 狌 犮 犻 犳 犲 狉 犪 )为莲科莲属多年水生草本植物,在中国南北各省均有种植,主要产于湖南、浙江等地,尤以湘莲最为著名,被誉为“中国第一莲子”。莲子富含淀粉、蛋白质、脂肪、多种维生素、糖类、钙、磷、铁和钾等营养成分,具有抑菌、抗炎、抗
4、氧化等药理作用。其药用有效成分以生物碱和黄酮类化合物为主,其中黄酮类化合物主要包括芦丁、金丝桃苷及槲皮素。有研究发现,金丝桃苷对肾组织具有保护作用;芦丁可通过下调 信号通路缓解右旋葡聚糖硫酸钠()诱导的大鼠溃疡性结肠炎();槲皮素具有抗氧化、抗病毒、抗炎及保护心、脑和肝脏的作用。黄酮的测定方法主要有超高效液相色谱法、荧光分光光度法、紫外可见分光光度法、高效液相色谱法、超高效液相色谱串联质谱法 等。其中,高效液相色谱法对中药材中的目标成分及杂质有很好的分离效果、高灵敏度、结果稳定和操作简单等优点,在黄酮分析检测中的应用较广。李静等 曾采用高效液相色谱法同时测定分心木中芦丁、金丝桃苷及槲皮素的含量
5、,但未见采用高效液相色谱法同时测定湘莲中芦丁、金丝桃苷及槲皮素含量的报道。研究拟建立采用高效液相色谱同时测定湘莲 中芦 丁、金 丝 桃 苷 和 槲皮 素 含 量 的 定 量 分 析方法。第 卷第期 总第 期 年月材料与方法材料与试剂芦丁 对 照 品:含 量 ,斯 坦 福 石 油 化 工 有 限公司;金丝桃苷对照品:含量,中国食品药品检定研究院;槲皮素对照品:含量,中国食品药品检定研究院;乙腈、甲醇:色谱纯,美国默克公司;磷酸、甲酸:分析纯,国药集团化学试剂公司;超纯水:实验室自制;湘莲:采自湖南省 个地市州,采摘时间为 年月,晒干。主要仪器设备高效液相色谱仪:型,带自动进样器,检测器,美国 公
6、司;电子分析天平:型,瑞士梅特勒托利多公司;纯化水系统:型,美国密理博公司。方法高效液相色谱条件色谱柱为 (,),二元流动相,流动相为甲醇,流动相为磷酸,采用梯度洗脱(洗脱程序:,;,;,;,;,),流速 ,柱温,检测波长 ,进样量。供试品溶液的制备湘莲样品干燥粉碎,取湘莲干燥粉末(粒径 ),精密称取约,置于 锥 形 瓶 中,加 乙 醇 约 ,超 声(,)处理,蒸发溶剂至约 ,离心(),收 集 上 清 液,用 氯 仿 萃 取次,收集乙醇层,蒸发溶剂至近干,加甲醇溶解并定容至,用微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。对照品溶液的制备精密称取芦丁 ,金丝桃苷 ,槲皮素 ,置 容量瓶中,用甲醇()乙
7、腈()溶解并稀释至刻度,摇匀,制成约 的标准储备液。精密量取标准储备液,分别置 容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,得到种成分的系列浓度的标准曲线工作液,每 含芦丁、金丝桃苷及槲皮素约为,。高效液相色谱条件优化()吸收波长:使用紫外分光光度计,对芦丁、金丝桃苷及槲皮素种待测成分在 范围扫描,选择最佳吸收波长。()流动相的优化:采用色谱柱为 (,),检测器,最佳检测波长,流速 ,柱温,检测波长 ,进样 量。比 较 不 同 流 动 相:乙 腈磷 酸 水 溶 液(,)、甲醇磷酸水溶液(,)对种黄酮类物质的分离效果。()溶剂 的 选 择:采 用 色 谱 柱 为 (,),检测器,最佳检测波长,流速 ,柱温
8、,检测波长 ,进样量。比 较 不 同 溶 剂 配 比(犞甲醇犞乙腈分 别 为 ,)对种黄酮类物质的分离效果。湘莲中芦丁、金丝桃苷及槲皮素提取方法的优化()湘莲粉末粒径选择:取种不 同 粒 径(,)的 湘 莲 干 燥 粉 末,采 用 超 声 提 取(,),提 取 时 间 为,蒸 发 溶 剂 至 约 ,离 心(),收 集 上 清 液,最 优 条件测定种黄酮类物质含量。()提 取 时 间 选 择:取 湘 莲 干 燥 粉 末(),采用超声提取(,),提取时间分别为,分别蒸发溶剂至约 ,离心(),收集上清液,最优 条件测定种黄酮类物质含量。()提 取 溶 剂 选 择:取 湘 莲 干 燥 粉 末(),采用
9、超声提取(,),提取时间,选择不同体积分数的甲醇和乙醇(甲醇、乙醇、甲醇、乙 醇、甲 醇、乙 醇、甲 醇、乙醇)作为溶剂提取湘莲中种黄酮,考察提取溶剂对湘莲中种黄酮类物质定量的影响。()料液比选择:取湘莲干燥粉末(),采用超声提取(,),提取时间,提取溶剂为 乙 醇,考 察 料 液 比,()对 湘 莲 中种 黄 酮 类 物 质 提 取 效 果 的影响。()提 取 方 法 选 择:取 湘 莲 干 燥 粉 末(),提取时间,提取溶剂为 乙醇,料液比(),分别采用超声(,)和热回流提取湘莲中种黄酮类物质,考察提取方法对湘莲中种黄酮类物质定量的影响。数据处理将仪器测得的数据结果使用 软件记录、处理计算
10、。提取色谱图通过仪器软件导出 数据文件,安全与检测 总第 期 年月使用 绘图软件重新绘制。结果与分析高效液相色谱图如图所示,按的色谱条件进样,芦丁、金丝桃苷和槲皮素的保留时间分别为 ,。样品中的目标峰具有良好的峰型和分离度,杂质峰对目标峰的含量测定没有干扰。因此,在该色谱条件下所测得的结果可以代表芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量。图混合对照品和样品 色谱图 色谱条件优化波 长 选 择精 密 量 取 项 下 供 试 品 溶 液,加甲醇定容至 容量瓶,摇匀。取芦丁、金丝桃苷及槲皮素对照品,加甲醇溶液(浓度适量)作对照,在紫外可见光分光光度计 进行全波长扫描,以甲醇为空白溶剂。结果供试品和芦丁、金丝桃苷
11、及槲皮素对照品均在 处有最大吸收,故确定其为检测波长。溶剂选择和优化如图所示,当溶剂中乙腈体积分数 时,槲皮素含量明显降低;以甲醇()乙腈()为溶剂时,槲皮素的色谱峰拖尾严重;以纯甲醇为溶剂时,芦丁及金丝桃苷分离度,而且芦丁色谱峰存在前延和变形问题。综合考虑目标物质峰的响应值、拖尾因子、分离度和峰宽,最终选择甲醇()乙腈()作为溶剂溶解稀释标准品。流动相的选择和优化芦丁和金丝桃苷的极性相似,但槲皮素的极性与二者相差较大,故选择梯度洗脱。如图所示,当流动相为甲醇磷酸水溶液和甲图不同溶剂的色谱图 ,钟菲菲等:法同时测定湘莲中芦丁、金丝桃苷及槲皮素含量图不同流动相的色谱图 醇磷酸水溶液时,种黄酮类物
12、质的分离效果差,可能是流动相的酸度不够;以甲醇磷酸水溶液为流动相时,种物质的目标峰分离效果较好,分离度均大于,且峰形较好。磷酸水溶液 为,考虑到 时会缩短色谱柱的使用寿命,因此不再选用更高酸度的磷酸水溶液作为流动相。与甲醇相比,乙腈作为流动相时,种黄酮类物质的保留时间靠前,湘莲药材的杂质峰可能会干扰目标物质的测定,综合考虑目标峰洗脱时间和分离效果,选择甲醇 磷酸水溶液作为流动相。提取条件优化湘莲粉末粒径对种目标物含量的影响由表可知,湘莲粉末粒径 或 时种黄酮类物质的提取率均比粒径为 的低,原因可能是粉末粒径过大,与溶剂接触的比表面积小,有效成分渗出少;粉末过细,颗粒表面积大,其吸附作用强,会影
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