脑卒中后脑血管内皮细胞内质网应激抑制Wnt7_β-catenin通路导致血脑屏障损伤的机制研究.pdf
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1、Vol.43 No.7 Jul.2023上海交通大学学报(医学版)JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)http:/上海交通大学学报(医学版),2023,43(7)脑卒中后脑血管内皮细胞内质网应激抑制Wnt7/-catenin通路导致血脑屏障损伤的机制研究董海平,谢海怡,马晓晓,王震虹上海交通大学医学院附属仁济医院麻醉科,上海 200120摘要 目的探讨缺血性脑卒中后脑血管内皮细胞Wnt7/-catenin信号失活是否导致血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)完整性破坏,并研究内质网应激爆发是否介导
2、了Wnt7/-catenin通路的抑制。方法采用线栓法阻断小鼠大脑中动脉建立大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,脑缺血60 min后拔除线栓。向MCAO模型小鼠腹腔注射内质网应激抑制剂 4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)作为 4-PBA+MCAO 组。并设置假手术组(Sham 组)。MCAO后24 h用伊文思蓝(Evans blue,EB)测定小鼠BBB的通透性,干湿法测定脑组织含水量,免疫荧光测定小鼠脑血管内皮细胞和周细胞黏附性。对人脑微细血管内皮细胞(human brain microvascu
3、lar endothelial cells,HBMECs)进行氧糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)4 h,加入4-PBA培养24 h。细胞实验分为空白对照组、OGD组和OGD+4-PBA组。采用CCK-8测定细胞活力,通过检测FITC标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)的通过率来评估细胞通透性;通过ELISA测定HBMECs中血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF-)的分泌水平;采用Fluo-3 AM钙离子荧光探针检测细胞的荧光强度并评估细胞内钙离子浓度,通过CM-H2DCFDA荧光探针测量活性氧
4、(reactive oxygen species,ROS)含量以明确细胞内质网应激状态;蛋白质印迹法(Western blotting)检测HBMECs中的连接蛋白紧密连接蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)和密封蛋白5(claudin-5)、内质网应激蛋白 CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶12(cysteine-containing asp
5、artate-specific proteases 12,Caspase-12)、Wnt7和-连环蛋白(-catenin)的表达水平。结果MCAO模型小鼠脑梗死区水含量较假手术组增加,EB渗出量明显增多(均P0.05),小鼠脑血管内皮细胞和周细胞之间的黏附性下降;腹腔注射4-PBA后MCAO模型小鼠脑水肿程度减轻,BBB的渗透性降低(均P0.05),脑血管内皮细胞和周细胞之间的黏附性增加。与空白对照组HBMECs比较,在OGD条件下细胞活力下降,通透性增加(均P0.05);同时,OGD组HBMECs中连接蛋白ZO-1、claudin-5的表达水平下降,PDGF-的分泌水平减少,钙离子浓度升高,
6、ROS含量明显上调,内质网应激蛋白CHOP、GRP78、Caspase-12的表达水平增加,Wnt7和-catenin的表达水平下降(均P0.05)。而当HBMECs的OGD模型经4-PBA处理后,OGD导致的HBMECs损伤减轻,细胞中连接蛋白的表达水平增加,HBMECs 的通透性降低,PDGF-的分泌水平增加,并且 Wnt7/-catenin 信号的活性明显恢复(均P0.05)。结论脑卒中后脑血管内皮细胞内质网应激爆发导致Wnt7/-catenin信号失活引起的内皮细胞损伤,是BBB破坏的关键途经。关键词内质网应激;Wnt7/-catenin;血脑屏障;缺血性脑卒中DOI10.3969/j
7、.issn.1674-8115.2023.07.005 中图分类号R743.33 文献标志码AMechanism of blood-brain barrier damage caused by the inhibition of Wnt7/-catenin pathway induced by endoplasmic reticulum stress in cerebrovascular endothelial cells after strokeDONG Haiping,XIE Haiyi,MA Xiaoxiao,WANG ZhenhongDepartment of Anesthesiolo
8、gy,Renji Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200120,China论著 基础研究基金项目 国家自然科学基金(82071290);上海市自然科学基金(20ZR1433400);上海市卫生健康委员会青年资助项目(20194Y0072)。作者简介 董海平(1988),女,主治医师,博士生;电子信箱:。通信作者 王震虹,电子信箱:。Funding Information National Natural Science Foundation of China(82071290);Shangha
9、i Natural Science Foundation(20ZR1433400);Youth Funding Project of Shanghai Municipal Health Commission(20194Y0072).Corresponding Author WANG Zhenhong,E-mail:.8292023,43(7)上海交通大学学报(医学版)Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)Abstract Objective To investigate whet
10、her the inactivation of Wnt7/-catenin signaling causes the destruction of the blood-brain barrier(BBB)in cerebrovascular endothelial cells after ischemic stroke,and investigate whether endoplasmic reticulum stress bursts mediates the inhibition of Wnt7/-catenin pathway.Methods The model of middle ce
11、rebral artery occlusion(MCAO)in mice was established by a monofilament nylon suture with a round tip,which was used to temporarily occlude the middle cerebral artery for 60 min.MCAO model mice were intraperitoneally injected with the endoplasmic reticulum stress blocker 4-phenylbutyric acid(4-PBA)as
12、 4-PBA+MCAO group.Sham surgery group(Sham group)was set.Twenty-four hours after MCAO,Evans blue(EB)was used to measure the BBB permeability.The brain water content was calculated by dry-wet weight ratio,and the adhesion of cerebrovascular endothelial cells and pericytes in mice was measured by immun
13、ofluorescence.Human brain microvascular endothelial cells(HBMECs)were used to establish an oxygen and glucose deprivation(OGD)model for 4 h,and then cultured with 4-PBA for 24 h.Cells were divided into blank control group,OGD group,and OGD+4-PBA group for CCK-8 assay to determine the cell viability.
14、FITC-labeled bovine serum albumin(FITC-BSA)was used to detect the cell permeability.The secretion of platelet-derived growth factor (PDGF-)was measured by ELISA.Fluo-3 AM fluorescence probe was used to detect the fluorescence intensity of cells to assess intracellular Ca2+concentration,and reactive
15、oxygen species(ROS)content was measured by CM-H2DCFDA fluorescence probe to clarify the endoplasmic reticulum stress state.Western blotting was used to examine the expression of connexins,including zonula occludens-1(ZO-1)and claudin-5,the expression of endoplasmic reticulum stress proteins,includin
16、g CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein(CHOP),glucose-regulated protein 78(GRP78),and cysteine-containing aspartate-specific proteases-12(Caspase-12),and the expression of Wnt7/-catenin in HBMECs.Results Compared with the Sham group,the brain water content of the infarction area of mice
17、increased after MCAO,and the exudation of EB increased significantly(both P0.05).The adhesion between cerebrovascular endothelial cells and pericytes in mice was reduced after the occurrence of MCAO.After intraperitoneal injection of 4-PBA in mice with MCAO,the degree of brain edema and the exudatio
18、n of EB were reduced(both P0.05),and the adhesion between cerebrovascular endothelial cells and pericytes increased.Compared with the HBMECs of the blank control group,the viability of HBMECs after OGD decreased,and the permeability of HBMECs increased(both P0.05).OGD condition also led to decreased
19、 expression of connexins(ZO-1 and claudin-5),decreased secretion of PDGF-in HBMECs,increased expression of endoplasmic reticulum stress proteins(CHOP,GRP78 and Caspase-12),up-regulated intracellular Ca2+concentration and ROS content,and decreased expression of Wnt7 and-catenin in HBMECs(all P0.05).A
20、fter HBMECs were cultured with 4-PBA,the damage of HBMECs caused by OGD was reduced,and the expression of connexins increased.The permeability of HBMECs was reduced,and the secretion of PDGF-was promoted(all P0.05).After 4-PBA treatment,the activity of Wnt7/-catenin signaling was significantly resto
21、red in the OGD model of HBMECs(P0.05).Conclusion Wnt7/-catenin signaling inactivation caused by endothelial reticulum stress bursts leads to cerebrovascular endothelial cell damage,which is the crucial pathway of BBB destruction after stroke.Key words endoplasmic reticulum stress;Wnt7/-catenin pathw
22、ay;blood-brain barrier(BBB);ischemic stroke脑卒中当前已成为威胁我国居民健康的主要原因之一,是造成我国减寿年数高的首位病因1。高达 67.3%80.5%的脑卒中为缺血性脑卒中(脑梗死)2,可能遗留严重残疾和肢体、语言等功能障碍,给患者和家庭均带来巨大的精神和经济压力,也给整个社会造成负担。血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)是维持脑组织代谢稳态的保障。研究3发现脑卒中后 BBB 的破坏对脑损伤起到了关键作用。血管内皮细胞是BBB的核心组成部分,其结构被破坏能引起脑卒中后脑水肿4。因此针对缺血性脑卒中后BBB特别是血管内皮细胞的损伤
23、机制研究有望为治疗干预这一疾病提供可能的突破点。内质网的主要功能是细胞内蛋白的加工、修饰以及合成,并为其他细胞器供给脂质,稳定细胞内Ca2+的浓度5。缺血缺氧等不良刺激可以引起细胞内质网伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白 78(glucose-regulated protein 78,GRP78)的表达增加;GRP78 与蛋白激酶 R 样内质网激酶 protein kinase R(PKR)-like endoplasmic reticulum kinase,PERK、转录激活因子6(activating transcription factor 6,ATF6)和真核翻译 起 始 因 子 2(eukary
24、otic initiation factor 2,eIF2)分离后,PERK激活GRP78和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP),促进非折叠蛋白积聚,内质网应激过度导致细胞损伤6。内质网应激还可以促进细胞氧化应激爆发,诱发过氧化损伤7-8。我们以往的研究9证实,脑卒中能诱导脑血管内皮细胞内质网应激的发生,并加重细胞损伤。因此,脑卒中后内质网应激是血管内皮细胞损伤和BBB破坏的重要环节。Wnt蛋白是一组保守的分泌型蛋白,可以激活下游-连环蛋白(-catenin);Wnt/-catenin
25、信号通路在细胞生物功能中发挥重要的作用10-11。近来一些研究4,12已证实Wnt/-catenin通路的失活是脑卒中后BBB功能损害的重要因素。其中Wnt7主要存在于血管系统中,特别是脑血管内皮细胞中,是神经系统830董海平,等脑卒中后脑血管内皮细胞内质网应激抑制Wnt7/-catenin通路导致血脑屏障损伤的机制研究http:/上海交通大学学报(医学版),2023,43(7)调节 BBB 的形成和维持其通透性的关键分子13-14,但Wnt7在脑卒中后脑血管内皮细胞中发挥的作用及机制还有待阐明。研究15发现,抑制人胚肾293细胞中内质网应激相关蛋白eIF2和CHOP的上调可以降低-caten
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