miR-21、SP-A、SP-D在肺纤维化患者血清及MRC-5细胞中的表达及其意义.pdf
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1、论著m i R 、S P A、S P D在肺纤维化患者血清及MR C 细胞中的表达及其意义李智陈俊伊(湖南省脑科医院I C U,湖南长沙 )摘要【目的】探讨微小R NA (m i R )、肺表面活性物质蛋白A(S P A)、肺表面活性物质蛋白D(S P D)在肺纤维化患者血清及MR C 细胞中的表达及其意义.【方法】收集 年 月至 年月本院收治的肺纤维化患者 例(肺纤维化组),另收集在本院体检的 例健康志愿者(健康组),检测两组血清中m i R 、S P A、S P D表达水平并比较.将MR C 细胞分为空载病毒对照组(转染无意义m i R NA慢病毒载体)、m i R 过表达组(转染m i
2、R 模拟物载体)和m i R 沉默组(转染抑制剂慢病毒载体),检测各组MR C 细胞中m i R 、S P A、S P DmR NA的表达水平并比较.【结果】肺纤维化组血清中m i R 及S P A、S P D水平显著高于健康组(P);m i R 过表达组S P A和S P D水平显著高于空载病毒对照组(P);m i R 沉默组S P A和S P D水平显著低于空载病毒对照组(P).【结论】m i R 、S P A和S P D可作为肺纤维化的生物标志物,且可通过沉默m i R 来抑制S P A和S P D的表达,从而抑制肺纤维化的发生和发展.关键词肺纤维化;微R NA s/血液;肺表面活性物质
3、相关蛋白质A/血液;肺表面活性物质相关蛋白质D/血液E x p r e s s i o na n dS i g n i f i c a n c eo fm i R ,S P Aa n dS P Di nS e r u ma n dMR C C e l l s o fP a t i e n t sw i t hP u l m o n a r yF i b r o s i s L I Z h i,CHEN J u n y i(D e p a r t m e n to f C r i t i c a l C a r e M e d i c i n e,B r a i nH o s p i t a l
4、 o fH u n a nP r o v i n c e,C h a n g s h aH u n a n )A b s t r a c t【O b j e c t i v e】T oe x p l o r e t h es i g n i f i c a n c ea n dr e l a t i o n s h i po fp u l m o n a r y f i b r o s i sw i t hm i R a n dS P A,S P Di ns e r u ma n dMR C c e l l so fp u l m o n a r yf i b r o s i sp a t i
5、 e n t s【M e t h o d s】F r o m O c t o b e r t oJ u n e ,p a t i e n t sw i t hP u l m o n a r yf i b r o s i s(t h ep u l m o n a r yf i b r o s i sg r o u p)a n d h e a l t h yv o l u n t e e r s(t h eh e a l t h yg r o u p)w e r er e c r u i t e d i no u rh o s p i t a l f o r t h es t u d y T h
6、ee x p r e s s i o n l e v e l so fm i R ,S P A,a n dS P Di ns e r u mo f t h e t w og r o u p sw e r ed e t e c t e da n dc o m p a r e d M e a n w h i l e,MR C c e l l sw e r ed i v i d e di n t oa ne m p t yv i r u sc o n t r o lg r o u p(t r a n s f e c t e dw i t hm e a n i n g l e s sm i R NAl
7、 e n t i v i r u s),am i R o v e r e x p r e s s i o ng r o u p(t r a n s f e c t e dw i t hm i R m i m e t i cv e c t o r),a n dam i R s i l e n c i n gg r o u p(t r a n s f e c t e dw i t h i n h i b i t o r l e n t i v i r u sv e c t o r)T h ee x p r e s s i o n l e v e l so fm i R ,S P A,a n dS
8、P DmR NAi nMR C c e l l s i ne a c hg r o u pw e r em e a s u r e da n dc o m p a r e d【R e s u l t s】S e r u ml e v e l so fm i R ,S P Aa n dS P Di nt h ep u l m o n a r yf i b r o s i sg r o u pw e r eh i g h e r t h a nt h o s e i nt h eh e a l t h yg r o u p(P)I nt h e c e l l e x p e r i m e n
9、t,l e v e l so fS P Aa n dS P Di nt h em i R o v e r e x p r e s s i o ng r o u pw e r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a nt h o s e i nt h ee m p t yv i r u sc o n t r o l g r o u p(P)A f t e rs i l e n c i n gm i R ,t h e l e v e l so fS P Aa n dS P Dw e r e s i g n i f i c a n t l y l o
10、 w e r t h a n t h o s eo f t h e e m p t yv i r u sg r o u p(P)【C o n c l u s i o n】m i R ,S P Aa n dS P Dc a nb eu s e da sb i o m a r k e r so fp u l m o n a r yf i b r o s i s A n dt h ee x p r e s s i o no fS P Aa n dS P Dd e c r e a s e sb yi n h i b i t i n gm i R ,w h i c hc a n i n h i b i
11、t t h eo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to fp u l m o n a r yf i b r o s i s K e yw o r d sP u l m o n a r yF i b r o s i s;M i c r o R NA s/B L;P u l m o n a r yS u r f a c t a n t A s s o c i a t e dP r o t e i nA/B L;P u l m o n a r yS u r f a c t a n t A s s o c i a t e dP r o t e i n
12、D/B L 中图分类号R 文献标识码Ad o i:/j i s s n 文章编号 (),肺纤维化(p u l m o n a r yf i b r o s i s,P F)是一种进行性间质性肺疾病,五年病死率在 左右,其早期病理改变是肺泡上皮细胞损伤,其中肺表面活性物质蛋白(p u l m o n a r ys u r f a c t a n t,S P)发挥了重要作医学临床研究 年月第 卷第期JC l i nR e s,A u g ,V o l ,N o 基金项目长沙市科学技术局基础研究项目(编号:k q )通讯作者,E m a i l:q q c o m用.有研究表明,S P A可反映肺损
13、伤程度,血浆中S P A水平越高,患者预后则越差.有研究显示,S P D可识别和清除肺内异物和凋亡细胞,患者血清中S P D的水平与肺纤维化严重程度相关,说明S P A和S P D均在肺纤维化中发挥了 重要作用.微小R NA(m i R NA)是单链非编码R NA,纤维化患者与正常人约有 种m i R NA表达迥异.笔者研究显示,m i R 和转化生长因子(t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r,T G F)在急性呼吸窘迫 综 合 征(a c u t er e s p i r a t o r y d i s t r e s ss y n d
14、r o m e,A R D S)所致的肺纤维化组织中表达水平升高.有研究结果显示,m i R 家族可影响S P A的表达;m i R 可通过抑制T G F/s m a d信号传导影响S P A表达.S P A和S P D是亲水性蛋白,参与免疫 炎 症 反 应 调 节,国 内 外 鲜 见 关 于m i R 及S P A、S P D与肺纤维化的相关性.本研究检测肺纤维化患者血清及MR C 细胞中m i R 及S P A、S P D的表达水平,分析其临床意义,现将结果报道如下.资料与方法一般资料收集 年 月至 年月本院已确诊为肺纤维化的 例患者(肺纤维化组),其中男 例,女 例;年龄 ()岁.另外,
15、选取同期在本院体检的 例健康志愿者(健康组),其 中男 例,女 例;年 龄 ()岁.两组男女比例、年龄等一般资料比较,差异无统计学意义(P).本研究经医院医学伦理委员会批准.纳入和排除标准纳入标准:肺纤维化组符合肺纤维化的临床诊断标准;年龄 岁;所有入选对象在此研究开始两周内未参加其他临床试验研究;健康组无间质性肺疾病病史及家族史,过去周未使用抗生素,且无急性呼吸道感染症状;所有入选对象均自愿参加,并签署知情同意书.排除标准:神志不清、痴呆等各种精神疾病患者;合并严重心功能不全;合并肝、肾疾病及其他呼吸系统疾病(支气管哮喘、支气管扩张等)、肿瘤.研究方法m i R 、S P A和S P D检测
16、采集肺纤维化组治疗时和健康组体检时空腹静脉血m L,静置h,r/m i n离心 m i n,留取血清,分装后放入 冰箱保存.采用实时荧光P C R检测m i R 表达水平:采用T R I z o l试剂提取血清标本中的总R NA,并溶解于无R N a s e的水中,使用紫外分光光度计检测每个样本总R NA的A /,取总R NAg,按反转录试 剂盒提供的 方法合成c D NA.取 L反转录产物进行P C R反应,反应条件为 预变性m i n,变性 s,复性 s,延伸k b/m i n,共 个 循 环.m i R 正向引物序列为 T C A AG C AAG AGAAGA AG G AT G A
17、,反 向 引 物 序 列 为 G C AG GAT T TAGA G G G GA CAGA A .U 作为m i R NA定量内参,采用公式 c t计算m i R 相对表达水平.采用E L I S A方法检测血清中S P A和S P D的蛋白水平:将血清标本放于冰上解冻,严格按照E L I S A试剂盒说明书进行操作.在 n m处检测各样品的O D值,每个样本将在同一E L I S A板上重复分析两次,根据标准品绘制的标准曲线计算各样品的浓度.细胞实验选取人胚肺成纤维细胞(MR C 细胞,购自北京协和细胞库),将MR C 细胞分为空载病毒对照组、m i R 过表达组及m i R 沉默组.将M
18、R C 细胞培养至对数生长期接种于孔板中,空载病毒对照组和m i R 过表达组及m i R 沉默组待细胞贴壁后,分别转染无意义m i R NA慢病毒载体、m i R 模拟物载体、转染抑制剂慢病毒载体,同时加入聚凝胺,采用实时荧光P C R法检测各组m i R 、S P A和S P DmR NA的相对表达量.统计学方法数据均采用S P S S 软件处理,计量资料以均数标准差(xs)表示,采用t检验,P 为差异有统计学意义.结果肺纤维化组和健康组血清中m i R 及S P A、S P D表达水平比较肺纤维化组血清中m i R 、S P A、S P D水平显著高于健康组,差异有统计学意义(P),见表
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