PEDV Nsp10基因真核表达载体的构建及蛋白的表达.pdf
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1、黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报第 35 卷doi:10.3969/j.issn.1002-2090.2023.04.012第 35 卷第 4 期2023 年8 月黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University35(4):7480Aug.2023收稿日期:2022-11-10基金项目:黑龙江省自然科学基金联合引导项目(LH2019C046)作者简介:牛欣雨(1996-),女,黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院 2020 级硕士研究生。通信作者:曹宏伟,女,教授,博士研究生导师,Emai
2、l:。PEDV Nsp10 基因真核表达载体的构建及蛋白的表达牛欣雨1,郑亮2,魏佳琪1,武峰峰1,吴志军1,3,张华1,2,3,曹宏伟1,2,3(1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆 163319;2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院;3.盐城师范学院)摘要:猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)为猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)的病原体。Nsp10 是 PEDV 编码的一种非结构蛋白,在病毒的复制过程中发挥着重要的作用。为研究在病毒侵染宿主细胞时 Nsp10 蛋白发挥的作用,通过 RT-P
3、CR 技术扩增 Nsp10 基因片段,利用同源重组的方法将 Nsp10 基因连接到 pCMV-Myc 载体,成功构建了 PEDV Nsp10 基因的真核表达载体。酶切鉴定及测序结果证实,PEDV Nsp10 基因成功克隆到 pCMV-Myc 载体中,并将重组质粒命名为 pCMV-Myc-Nsp10。将重组质粒 pCMV-Myc-Nsp10 通过脂质体转染至 IPEC-J2 细胞中,利用 Western Blot 和间接免疫荧光技术检测 pCMV-Myc-Nsp10 的表达以及定位情况。结果显示,pCMV-Myc-Nsp10 在 IPEC-J2 细胞中成功表达,并且均匀分布在细胞质和细胞核中,为
4、后续研究 PEDV Nsp10 蛋白的生物学功奠定了基础。关键词:猪流行性腹泻病毒;真核表达载体;Nsp10 蛋白;蛋白表达中图分类号:S852.651文献标识码:A文章编号:1002-2090(2023)04-0074-07Construction of Eukaryotic Expression Vector and ProteinExpression of PEDV Nsp10 GeneNiu Xinyu1,Zheng Liang2,Wei Jiaqi1,Wu Fengfeng1,Wu Zhijun1,3,Zhang Hua1,2,3,Cao Hongwei1,2,3(1.College
5、 of Life Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319;2.College of Animal Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University;3.Yancheng TeachersUniversity)Abstract:Porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)was the pathogen of porcine epidemic diarrhea(PED).
6、Nsp10 was a non-structural protein encoded by PEDV,which played an essential role in the replication of the virus.To study the role of Nsp10 proteinin virus infection of host cells,Nsp10 gene fragment was amplified by RT-PCR technology and connected to the pCMV-Myc vectorby double enzyme digestion,t
7、he eukaryotic expression vector of PEDV Nsp10 gene was successfully constructed.Enzyme digestionidentification and sequencing results confirmed that the PEDV Nsp10 gene was successfully cloned into the pCMV-Myc vector,andthe recombinant plasmid was named after pCMV-Myc-Nsp10.The recombinant plasmid
8、pCMV-Myc-Nsp10 was transfected intoIPEC-J2 cells by liposome,and the expression and localization of pCMV-Myc-Nsp10 by Western Blot and indirectimmunofluorescence were explored.The results showed that pCMV-Myc-Nsp10 was successfully expressed in IPEC-J2 cells andevenly distributed in cytoplasm and nu
9、cleus,which would provide a theoretical basis for subsequent studies on the biologicalfunctions of PEDV Nsp10 protein.Key words:PEDV;eukaryotic expression vector;Nsp10 protein;expression of protein猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起一种急性肠道传染病,主要以高度接触性传染而广泛传播1。感染此病毒的猪多伴有严重的腹泻、呕吐、脱水等特征,多感染哺乳仔猪,且具有较高的感染率和死亡率。不同年龄段的猪感染率不
10、同,但一般年龄越小的猪感染率越高,死亡率也越高2。猪流行性腹泻首次爆发于欧洲英国,但目前已经成为威胁到包括中国、韩国、日本等在内的亚洲各个国家养猪业的严重第 4 期传染性疾病,给亚洲乃至世界各国养猪业造成了致命性的打击3。PEDV 是一种正链单股 RNA 病毒,基因组全长约为 28 kb4-6。PEDV 基因组共编码蛋白 21 种,其中包括 4 种结构蛋白(E 蛋白、M 蛋白、N 蛋白及 S 蛋白)和 16 种非结构蛋白 Nsp1-16 以及一个辅助蛋白ORF37-9。这些蛋白共同协调着病毒的复制与增值。Nsp10 是 PEDV 编码的非结构蛋白,由 135 个氨基酸残基构成,是一种具有核苷-
11、2-O-甲基转移酶活性的辅助蛋白10。生物信息学分析发现 Nsp10 蛋白是一种锌指结合蛋白,在冠状病毒(包括玉、域、芋型)中,和锌螯合的所有氨基酸均比较保守11。此外,也有研究表明,SARS-Cov Nsp10 蛋白可以与 DNA或单双链 RNA 中非特异性的核苷酸结合并且可通过与多种蛋白如 Nsp1、Nsp7 等相互作用来参与复制复合体的形成12-13;SARS-Cov-2 Nsp10 蛋白可以拮抗玉型干扰素产生的免疫应答反应14;MHV Nsp10蛋白可以结合锌离子并且在体外与 ssDNA、dsDNA、ssRNA 及 tRNA 结合15;冠状病毒的 Nsp10 蛋白是一种可以激活多种复制
12、酶的关键辅助因子,它可以与Nsp14 和 Nsp16 相互作用,并调控它们各自的外显子和核糖-2-O-甲基转移酶的活性16-17;猪 啄 冠状病毒Nsp10 蛋白以一种不依赖于锌指结构域的方式拮抗茁-干扰素的产生18。这些结果说明,对于冠状病毒来说 Nsp10 蛋白对基因组和亚基因组 RNA 合成以及病毒多聚蛋白的加工有着极其重要的作用19-20。到目前为止,对于冠状病毒 Nsp10 作用机制研究的报道还相对较少,对于 PEDV Nsp10 蛋白的研究也相对较少。研究通过构建 PEDV Nsp10 基因真核表达载体,利用免疫印迹技术(Western Blot)与间接免疫荧光技术鉴定其表达及亚细
13、胞定位情况,为进一步探究 PEDV Nsp10 蛋白的生物学功能以及特性奠定了一定的基础。1材料与方法1.1 材料IPEC-J2 细胞由生物技术中心 509 实验室于-80 益冻存复苏;小鼠抗 Myc 单抗(mAb)、小鼠抗 茁-actin单抗(mAb)、山羊抗小鼠辣根酶标记 IgG 以及 FITC标记的山羊抗小鼠 IgG 均购自北京中衫金桥生物技术公司;DMEM 培养基、胎牛血清(fetal cattle serum,FBS)和 LipofectamineTM2000购自英潍捷基(Invitro原gen)上海贸易有限公司;质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒均购于 Omega 公司;限制性内切酶 E
14、coR玉和Xho玉、2伊Seamless 无缝克隆酶、PCR 及反转录试剂盒购自 TaKaRa 公司;特异性引物合成及重组质粒的序列测定均由擎科生物(北京)公司完成;病变组织猪小肠由生物技术中心 509 实验室保存;试验选用的 DH5琢 感受态细胞及所需的 pCMV-Myc 载体均由生物技术中心 509 实验室保存。1.2 引物设计及表达载体构建路线找出已经发表在 NCBI-GeneBank 上的 PEDV(NC_003436.1)标准序列作为模板序列,利用 primer5 软件设计 PEDV Nsp10 基因的特异性上下游引物,特 异 性 上 游 引 物 序 列:GCCA TGGAGGCCC
15、原GAATTCGGATGGCTGGTAAACAAACAGAACAGGC-TAT-3(含 EcoR 玉位点),特异性下游引物序列:CGCGGCCGCGGTACCTCGAGATTGCATAATGGAT-CTGTCACAAG TG(含 Xho玉位点)。利用酶切连接的方式将 PEDV Nsp10 基因插入 pCMV-Myc 的 EcoR玉/Xho玉位点之间。构建以 pCMV-Myc 为载体的PEDV Nsp10 蛋白融合表达载体。1.3 扩增 PEDV Nsp10 基因将病变组织猪小肠用液氮进行研磨,将其放于1.5 mL EP 管中,剧烈摇晃 1 min 后静止 10 min,加入冰冷的三氯甲烷试剂,
16、快速摇晃 20 s。静止 15 min后,在转速为 12 000 r min-1,4 益离心机中离心15 min。离心停止后,取离心管中的上层澄清液于新的 EP 管内,将 600 滋L 异丙醇加入装有上述澄清液的 EP 管中,轻轻摇晃 15 s,让两者混匀,静止时间为10 min。随后 4 益离心机中离心 10 min,转速为12 000 r min-1。倒掉上清,向沉淀中加入 75%的乙醇(用 DEPC 水现配现用)600 滋L,静止 10 min。倒掉上清,吹干剩余液体,向 EP 管中的沉淀加入 20 滋L 的DEPC 水助溶,静止 10 min,在-80 益冰箱中保存。试验过程中所用的耗
17、材需要提前用 DEPC 水处理,4 益离心机需提前预冷。RNA 提取完毕后,加入 Oligo(dT)1 滋L、SpecificPrimer 2 滋L、DEPC 水 2 滋L;反应条件为 70 益 10 min。向上述管中加入以下试剂混合液,dNTP mix(10 mM)0.5 滋L、RNase Inhibitor 0.5 滋L、5 伊M-MLV buffer2 滋L、RNase M-MLV 1 滋L、DEPC 水 1 滋L,总反应体系 5 滋L;将上述液体混匀后放入 PCR 仪中,PCR 程序为:30 益 10 min,42 益保温 60 min,70 益保温15 min。以此得到的 cDNA
18、 为模板,加入上下游引物各 0.2 滋L,buffer 3 滋L,dNTP 2 滋L,PCR 酶 0.13 滋L,牛欣雨等:PEDV Nsp10 基因真核表达载体的构建及蛋白的表达75黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报第 35 卷去离子水 13.47 滋L,总反应体系为 20 滋L;将上述液体混匀后放入 PCR 仪中,PEDV Nsp10 基因 PCR 程序为:94 益 10 min;94 益 45 s,60 益 45 s,72 益 1 min(共 35 次循环);72 益 10 min。结束后点样跑胶,之后切下本试验的目的条带,利用试剂盒对目的产物进行回收,回收到的目的片段溶在 20
19、 uL 去离子水中-20 益冷冻冰箱中保存。1.4 Nsp10 基因真核表达载体的构建及鉴定将 Nsp10 基因片段和 pCMV-Myc 载体分别用EcoR玉与 Xho玉双酶切,试验条件为 37 益,2 h,利用Omega 试剂盒进行胶回收。将切下的DNA 胶用700 滋L Binding Buffer 于 60 益水浴锅中溶解 10 min。将溶解后的混合液体倒入收集柱,于离心机中12 000 r min-1离心 1min,该过程重复一次。随后弃掉下管液体,向上柱加入 300 滋L Binding Buffer 将其溶解,12 000 r min-1离心 1 min。弃去下层液体,向上管中加
20、入 700 滋L Wash Buffer,12 000 r min-1离心1 min。丢弃下管液体 13 700 r min-1空离 2 min。离心后向上管加入 30 滋L 已经加热到 60 益 左右的去离子水,静止溶解 5 min 后 13 700 r min-1离心 2 min,得到纯化的基因片段和载体片段。将上述两种纯化所得到产物,加入 2伊Seamless 无缝克隆酶及去离子水,总体系为 10 滋L,于 PCR 仪中 50 益 15 min。连接产物转化涂板,于培养箱培养 12 h。挑取大小饱满的单一菌落,于 37 益摇床培养 10-12 h 后,提取质粒。经 PCR 和双酶切鉴定成
21、功后,于-20 益保存。取出10 滋L 质粒送至公司进行测序,将正确质粒命名为pCMV-Myc-Nsp10。1.5 Western Blot 检测将 IPEC-J2 细胞均匀铺在 24 孔板中,待细胞密度长到 80%左右时,进行转染,步骤如下:用 Lipo原fectin2000分别将 pCMV-Myc 和 pCMV-Myc-Nsp10 质粒转染至细胞中,将转染后的细胞板于 37 益 5%CO2培养箱培养。培养 6 h 以后,将原 24 孔板中的DMEM 换为 10%FBS,继续培养 18 h 后,收取蛋白样品。收样:PBS 轻轻清洗细胞 23 次后,每孔加入3050 滋L RIPA 裂解液裂解
22、细胞半个小时,该过程需要在 4 益低温下进行,用枪头刮取细胞,4 益离心机12 000 g 离心 10 min,吸取上清裂解液至新的 EP 管中。加入 5伊Loading Buffer,100 益沸水浴煮样 10 min,随后 12 000 g 离心 10 min。跑胶:配胶,等待胶凝固以后,组装胶和电泳槽,在确定不漏的情况下倒入 1伊SDS 电泳液,插上电极,分离蛋白样品;转膜:将胶板撬开,按照条带大小切下对应胶条,组装转膜装置,用 PVDF 膜吸附蛋白,冰水混合物中转膜电压 200 V,电流 240 A,时间为 2 h。封闭:取 10 mL 1伊TBST,向里面添加 0.5 g 脱脂奶粉。
23、将 PVDF 膜放入混匀后的封闭液中,摇床封闭孵育 2 h。结束后用 1伊TBST 溶液洗膜 2 h,期间需要更换 1伊TBST。孵育抗体:用鼠源茁-actin 单抗(1颐1 000)、鼠源 Myc 单抗(1颐1 000)作为一抗,山羊抗小鼠辣根酶标记 IgG(1颐1 000)作为二抗各孵育 2 h,每次孵育结束后需用 1伊TBST 溶液洗膜2 h,洗膜时间,每次 15 min;每次洗膜均在摇床上进行。曝光:用 AI600 仪器曝光,保存结果图片。1.6 间接免疫荧光细胞传代爬片,待细胞密度长到 60%左右时,用Lipofectin2000分 别 将 pCMV-Myc 和 pCMV-Myc-N
24、sp10 质粒转染至 IPEC-J2 细胞中,于 37 益 5%CO2培养箱培养,6 h 后将 DMEM 更换为 10%FBS。继续培养 18 h 后,吸弃上层细胞培养基,之后用灭菌后的PBS 洗细胞 2 次,每孔加入 500 滋L 4%的多聚甲醛,室温固定 20 min;PBS 洗细胞共 3 次,15 min 次-1。加入 0.1%Triton X-100,室温透膜 20 min;PBS 清洗细胞 3 次,15 min 次-1;加入 5%BSA 封闭 2 h(5%BSA需要现用现配),用鼠源 Myc 单克隆抗体(1:500)作为一抗孵育 1 h;PBS 洗 3 次;加入荧光素标记的山羊抗小鼠
25、 IgG(1颐500)作为二抗室温避光孵育 2 h;孵育结束后 PBS 洗 3 次。最后取干净且灭菌后的载玻片,滴少量的封片剂,用针头挑出爬片,将带有细胞的面放在封片剂上,用纸巾轻轻将多余的液体吸干,压紧,再将指甲油均匀涂抹在爬片周围,阻止细菌进入细胞中。将载玻片在避光处晾干,待片子干燥后用荧光显微镜观察拍照,并保存图片。2结果与分析2.1 Nsp10 基因片段的 PCR 扩增在研究中,利用设计的 PEDV Nsp10 的特异性上、下游引物对其进行 PCR 扩增,电泳后在大约在400 bp 处出现目标条带,即为特异的 Nsp10 基因片段,结果如图 1 所示。2.2 真核表达载体 pCMV-M
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