HAX-1调控人宫颈癌Hela的细胞增殖.pdf
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1、:调查研究 调控人宫颈癌 的细胞增殖季瑞,唐敏,徐海波,姚涓,陆云燕,金华,(南通大学附属肿瘤医院 妇瘤科,中心实验室,江苏南通;南通大学医学院,江苏南通)摘要:目的 探讨造血细胞特异性蛋白()相关蛋白()对宫颈癌 细胞增殖的调控作用。方法 以人宫颈癌 细胞系为研究模型,采用脂质体介导法将 和阴性对照 转染 细胞并构建 沉默细胞系(沉默组),以 高表达质粒和 空载质粒转染 细胞并构建 过表达细胞系(过表达组)。采用实时荧光定量()和 检测转染后 细胞中 的表达情况;试验检测转染后的细胞增殖能力;试验检测转染后的细胞活力;流式细胞术检测 对转染后 细胞周期和细胞凋亡的变化;检测转染后、基因的表达
2、水平。结果 沉默 后,细胞中 和蛋白质的水平显著降低,而过表达 后,细胞中 和蛋白质的水平显著升高,差异均有统计学意义()。过表达 后,过表达组中 阳性细胞数目下降,细胞活力降低,期细胞比例增加,期细胞比例降低,细胞凋亡率上升,增殖相关基因 表达降低,基因显著降低(),而 沉默组则具有相反的表现。结论 的表达抑制了 细胞增殖,并通过 途径诱导其凋亡。关键词:造血细胞特异性蛋白 相关蛋白;宫颈腺癌;凋亡;细胞增殖中图分类号:文献标志码:,(,;,):(),()()(),(),(),:;宫颈癌严重威胁妇女身心健康,其发病率居妇科恶性肿瘤首位。一项病因学研究提示,肿瘤的发生和发展与细胞的病理性增殖和
3、异常凋亡密切相关。因此,积极探寻各种信号网络在宫颈癌发生和发展复杂调控过程中的作用是非常有必要的。造血细胞特异性蛋白(临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ,基金项目:江苏省高层次卫生人才“六个一工程”拔尖人才科研项目();南通市科技计划指导性项目();南通市卫建委项目面上课题()。作者简介:季瑞,年生,男,副主任医师,硕士,研究方向:妇科恶性肿瘤的临床诊治与研究。通信作者:金华,主任技师,:。,)相关蛋白(,)由 基因编辑,其蛋白质相对分子量()为,含有 个 端酸性区,个结构域(和),并与 具有同源性。既往研究表明,的纯合突变与急性先天性中性粒细胞减少症的发生相关,并可能引起女性青春期延迟和性腺
4、功能障碍。近年来的研究进一步提示,在胃癌、肝癌等肿瘤中呈高表达或过表达,参与了多种重要的生理过程,包括调节细胞侵袭、凋亡、增殖和内吞,以及与 非翻译区的结合等。然而,在宫颈腺癌细胞增殖过程中 的作用机制如何目前仍未可知。本研究拟检测并观察 沉默及过表达后,对人宫颈腺癌 细胞系生物学行为的影响。材料和方法 细胞系、主要试剂与仪器 人宫颈癌细胞 细胞系(中国科学院上海生命科学研究院细胞库)。、试剂盒、试剂盒(上海生工公司),()质粒、质粒载体(上海和元生物技术公司),细胞培养基、凋亡检测试剂盒、胎牛血清(美国 公司),第一链反转录试剂盒()、预染色蛋白质分子量标准()均购自日本 公司,荧光定量 试
5、剂(,瑞士 公司),发光试剂盒(美国 公司),、试剂(美国赛默飞公司),细胞裂解液、蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天公司),兔抗人 多克隆抗体(英国 公司),小鼠抗人 单克隆抗体、辣根过氧化物酶()标记的羊抗兔 及羊抗鼠 抗体(德国默克公司),细胞周期检测试剂盒(杭州联科生物公司)。正置荧光显微镜(德国卡尔蔡司公司),倒置荧光显微镜(德国 公司),细胞培养箱(日本 公司),荧光定量 仪(美国 公司),化学发光凝胶成像系统、垂直电泳槽、半干转移系统(美国 公司),多功能酶标仪(美国 公司),流式细胞仪(美国 公司)。方法 过表达载体和 过表达模型使用()质粒作为载体,在表达载体中插入()序列构建过
6、表达质粒。采用 软件设计引物序列,引物由上海生工公司合成。上游引物序列():,含 限制性位点(加粗斜体部分);下游引物序列():,含 限制位点(加粗斜体部分)。循环参数:;,循环 次;,保存。产物双链定向克隆至载体,转化大肠埃希菌 中扩增,筛选阳性克隆,鉴定,测序。由上海和元生物技术公司合成,序列:;序 列:;序 列:;序列:。每个 合成 ,加入 水配制成 储存液,分装保存于,用于后续 细胞转染。细胞培养与转染 取 含 胎牛血清的 培养液加入至 培养瓶,另取生长状态良好的 细胞以 个 孔的细胞密度接种,置 、培养箱中培养。待细胞融合度达 时,用 胰蛋白酶消化细胞并进行后续试验。按 个 孔的细胞
7、密度接种至 孔培养板中培 养 至 融 合 度 达 时,按 说明书操作进行转染。过表达质粒转染:每孔按 过表达质粒或对照 质粒及 转染试剂的剂量加入至 基础培养基中,形成转染复合物,室温平衡 后转染 细胞。转染 后将 基础培养基更换为含胎牛血清的 培养液继续培养 。过表达 细胞分组:组和 组;沉默 转染:每孔按 或阴性对照()及 转染试剂的剂量加入至 基础培养基中,形成转染复合物,室温平衡 后转染 细胞。转染 后将 基础培养基更换为含 胎牛血清的 培养基继续培养 。沉默 细胞分组:组、组、组和 临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ,组。引物设计及实时荧光定量()根据 中、和 基因的序列号,用 软件
8、设计引物,并送上海和元生物技术公司合成,引物序列见表。按逆转录试剂盒说明书将 逆转录为,并置于 保存。总反应体系为 ,包括 (),上、下游引物各,模板 ,无菌 补足体积。反应参数:;,延伸 ,共 个循环。使用 软件采集荧光信号并进行熔解曲线分析,各基因的相对表达水平以 法计算,公式:(实验组目的基因实验组 内参基因)(对照组 目的基因对照组 内参基因)。每组设 个复孔,重复 次。表 引物序列基因引物序列()产物大小()值()文献:取 过表达 细胞(组和 组)和 沉默 细胞(组、组、组和 组),按 个 孔的细胞密度接种至 孔培养板,待细胞融合度达 时,用细胞裂解液裂解并刮取细胞,、离心,取上清液
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