小麦TaPAT1-2D基因的克隆与表达分析_董飞燕.pdf
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1、浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis,2023,35(1):23 32http:/www zjnyxb cn董飞燕,宋婧含,张华东,等 小麦 TaPAT1-2D 基因的克隆与表达分析 J 浙江农业学报,2023,35(1):23 32DOI:10.3969/j issn 1004-1524.2023.01.03收稿日期:2022-04-06基金项目:湖北省自然科学基金(2021CFB393);湖北省中央引导地方科技发展专项(2020ZYYD011);国家小麦产业技术体系建设专项(CARS-03)作者简介:董飞燕(1997),女,河南驻马店人,硕士研究生,
2、研究方向为小麦育种栽培。E-mail:2064276160 qq com*通信作者,方正武,E-mail:fangzhengwu88163 com;刘易科,E-mail:hbliuyk foxmail com小麦 TaPAT1-2D 基因的克隆与表达分析董飞燕1,2,宋婧含1,3,张华东1,2,吴昊天2,李雅倩1,2,刘孟伟2,高春保1,2,方正武1,*,刘易科2,*(1 长江大学 农学院,农业农村部长江中游作物绿色高效生产重点实验室(部省共建),湖北 荆州 434025;2 湖北省农业科学院 粮食作物研究所,粮食作物种质创新与遗传改良湖北省重点实验室,农业农村部华中地区小麦病害生物学科学观测
3、实验站,湖北 武汉 430064;3 浙江大学 农业与生物技术学院,浙江 杭州 310058)摘要:GRAS(GIBBERELLIN-INSENSITIVE,repressor of ga1-3 and SCARECROW)基因家族作为重要的植物转录因子在调控植物生长发育、抵抗逆境胁迫的各种信号转导途径中发挥重要作用。为进一步挖掘该家族小麦抗赤霉病相关基因,从禾谷镰刀菌诱导的小麦转录组测序数据筛选出差异表达基因 TaPAT1-2D(TraesCS2D02G198200.1),克隆该基因的全长序列,并对其进行生物信息学和表达模式分析,以及亚细胞定位和酵母转录激活活性研究。生物信息学分析结果表明:
4、TaPAT1-2D 序列全长 1 668 bp,编码 555 个氨基酸,分子量约为 61.34 ku;TaPAT1-2D 蛋白含有典型 GRAS 功能结构域,在进化关系上与水稻 OsCIGR2(LOC_Os07g39470.1)关系较近;TaPAT1-2D 启动子区包含茉莉酸甲酯、脱落酸、生长素等植物激素响应元件与光应答元件等。实时荧光定量 PCR 结果显示,接种禾谷镰刀菌孢子液 72 h 后,TaPAT1-2D 基因在 4 个不同赤霉病抗性小麦品种中的相对表达水平明显上调,表明该基因参与赤霉病的响应过程。农杆菌介导的烟草中瞬时表达试验结果表明,TaPAT1-2D 蛋白定位于细胞核和细胞膜中。
5、酵母转录激活活性实验表明,TaPAT1-2D蛋白具有转录自激活能力。研究结果为深入研究 TaPAT1-2D 基因的功能奠定了基础。关键词:小麦;GRAS 转录因子;亚细胞定位;表达分析;自激活中图分类号:S512文献标志码:A文章编号:1004-1524(2023)01-0023-10Clonging and expression analysis of TaPAT1-2D gene in wheatDONG Feiyan1,2,SONG Jinghan1,3,ZHANG Huadong1,2,WU Haotian2,LI Yaqian1,2,LIU Mengwei2,GAO Chun-bao
6、1,2,FANG Zhengwu1,*,LIU Yike2,*(1 MARA Key Laboratory of Sustainable Crop Production in the Middle Reaches of the Yangtza River(Co-Construc-tion by Ministry and Province),College of Agronomy,Yangtze University,Jingzhou 434025,Hubei,China;2 HubeiProvincial Key Laboratory of Germplasm Innovation and G
7、enetic Improvement of Food Crops,Wheat Disease BiologyResearch Station on Central China,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Food Crops Institute,Hubei Academy ofAgricultural Sciences,Wuhan 430064,China;3 College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)Abstrac
8、t:As a plant-specific transcription factor,the GRAS(GIBBERELLIN-INSENSITIVE,repressor of ga1-3and SCARECROW)gene family plays a vital role in plant growth and stress tolerance To further explore the geneinvolved in response to Fusarium head blight of wheat in this family,the research screened out th
9、e differentially ex-pressed gene TaPAT1-2D(TraesCS2D02G198200.1)from the Fusarium graminearum spore-induced wheat transcrip-tome sequencing data,and conducted its full-length cloning,bioinformatics analysis,expression pattern analysis,subcellular localization,and transcription activation studies The
10、 results of bioinformatics analysis showed that theexon sequence of TaPAT1-2D was 1 668 bp,encoded 555 amino acids,and had a molecular weight of around 61.34ku Its protein sequence comprised a typical GRAS functional domain and was phylogenetically related to rice OsCI-GR2(LOC_Os07g39470.1)In the pr
11、omoter region,TaPAT1-2D contained some plant hormone response elementsand light-responsive elements including methyl jasmonate response elements,auxin response elements,abscisic acidresponse elements,Etc Quantitative real-time PCR results revealed that expression level of TaPAT1-2D gene wasup-regula
12、ted at 72 h after inoculating with F graminearum spore liquid in four distinct resistants,indicating that thisgene was involved in response to Fusarium head blight Agrobacterium tumefaciens-mediated transient expression wascarried out in tobacco and the result showed that TaPAT1-2D protein was local
13、ized in the nucleus and cell membraneThe yeast transcription activation experiments verified that the protein could self-activate transcription This studylaid the foundation for studing TaPAT1-2D genes functionKey words:wheat;GRAS transcription factor;subcellular localization;expression analysis;sel
14、f-activation作为世界上重要的粮食作物之一,小麦为全球五分之一的人口提供粮食,因此保证小麦稳产和高产具有重要意义。小麦在生长发育过程中会面临各种逆境因素,近年来由于全球温度升高和小麦耕作制度的改变,小麦赤霉病发生频率逐渐增加1。小麦赤霉病又称烂穗病,是由多种镰刀菌侵染所引起的一种世界性病害,导致苗腐、茎基腐、秆腐和穗腐,其中,穗腐危害最为严重,湿度大时,发病部位可见粉红色霉层。小麦赤霉病影响小麦产量和质量,而且感病小麦中镰刀菌合成的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON,又称致吐毒素)会严重影响食品安全,危及人畜健康2。提高小麦品种抗病性是赤霉病防控最为经济、环保且
15、有效的手段,而挖掘小麦抗赤霉病基因,对抗病品种培育至关重要。GRAS 蛋白作为植物重要的转录因子,在多种信号转导途径中发挥重要作用。早期在拟南芥中根据结构差异将 GRAS 蛋白家族分为 8 个亚家族,即 DELLA、SCR、LS、PAT1、HAM、SCL3、SHR 和 LISCL 亚家族3。不同亚族在植物生长发育过程中发挥着不同功能,包括参与调控分生组织 的 形 成4、根 发 育5 8、赤 霉 素 信 号 转导9 10、光信号转导11 12、逆境胁迫应答13 等过程。但是目前针对参与生物胁迫的报道相对较少,主要聚焦在对病原菌的响应。Chen 等14 发现,被大麦条纹花叶病毒(Barley st
16、ripe mosaicvirus)侵染后,小麦 TaSCL14 基因沉默植株细胞内的丙二醛(MDA)含量高于野生型,且细胞损坏程度大,间接说明 TaSCL14 基因对增强植株抵抗生物胁迫能力具有重要作用。Mayrose 等15 研究发现,在番茄受到丁香假单胞菌侵染时,番茄的 6个 SIGRAS 基因转录子表达水平上调,表明 SI-GRAS 基因可能参与由细菌触发的防御反应,响应生物胁迫。Day 等16 从水稻中发现了能被共培养的稻瘟病菌和 N-乙酰基壳寡糖激发子诱导的两个 AtPAT1 亚家族成员 OsCIGR1 和 OsCI-GR2,其可能在防御病原真菌信号的早期阶段中发挥转录调控的关键作用
17、。林源17 通过稻瘟病抗性实验发现,同属 PAT1 分支的小佛肚竹 BvCI-GR 基因能在一定程度上增强植株对稻瘟病的抵抗能力。由此推测,GRAS 基因家族在小麦响应生物胁迫过程中发挥重要作用。分析小麦 GRAS 基因家族的转录组数据发现,禾谷镰刀菌侵染中国春小麦花序 4 d 后,PAT1 分支的 TaPAT1-2D 基因与对照相比表达量显著上调,说明 TaPAT1-2D 基因具有受禾谷镰刀菌诱导的特性18。本研究从中国春小麦中克隆了 TaPAT1-2D 基因,对其进行生物信息学分析、亚细胞定位、表达特性分析和酵母转录激活活性验证,为进一步研究 TaPAT1-2D 基因的功能奠定基础,也为探
18、明 GRAS 家族基因在抵御病原菌侵染中的作用提供参考和依据。1材料与方法42浙江农业学报第 35 卷第 1 期1.1材料供试小麦品种苏麦 3 号、扬麦 158、安农8455、鄂麦 170 和本氏烟草(Nicotiana benthami-ana)均由本实验室保存,禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)黄冈 1 号由湖北省农业科学院植物保护研究所提供。RNA 提取试剂、RNA 反转录试剂盒 Prime-ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time),宝日医工程大连有限公司;高保真酶PhantaMax Super
19、-Fidelity DNA Polymerase,南京诺唯赞生物科技股份有限公司;DNA 纯化回收试剂盒、无缝克隆试剂盒 Minerva Super Fusion Clo-ning Kit、2 SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒,苏州宇恒生物科技有限公司;限制性内切酶EcoR、BamH、Xba I 和 Sal I,宝日医工程大连有限公司;大肠埃希菌感受态细胞 DH5a、农杆菌感受态细胞 GV3101,上海昂羽生物技术有限公司;酵母菌感受态细胞 AH109,上海唯地生物技术有限公司。1.2方法1.2.1材料处理在小麦开花期,将禾谷镰刀菌孢子液(5 105mL1)接种于不
20、同赤霉病抗性的小麦上(苏麦 3 号为高抗,扬麦 158 为中抗,安农 8455 为高感,鄂麦 170 为中感)。在接种后 24、48、72、96 h对接种小穗进行取样,所收集的样品立即用液氮冷冻,并转至 80 冰箱冻存备用19。1.2.2目的基因克隆各小麦品种小穗的总 RNA 提取采用 Trizol法20。将 RNA 反转录合成 cDNA,于 20 保存。根据 TaPAT1-2D(TraesCS2D02G198200.1)基因序列,利用 Primer Premier 5.0 设计特异性引物 pCAMBIA2300-TaPAT1-2D-GFP-F/R(表 2),以中国春 cDNA 为模板,利用高
21、保真酶进行 PCR扩增,反应体系和反应程序参照说明书,对载体pCAMBIA2300 进行 Xba/Sal双酶切,酶切产物和 PCR 产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后用 DNA 纯化回收试剂盒纯化回收。利用无缝克隆试剂盒将 TaPAT1-2D 编码序列(coding se-quence,CDS)连接到 pCAMBIA2300 载体,得到融合表达载体,转化大肠埃希菌 DH5a 感受态细胞,经抗性筛选,挑取单克隆进行阳性检测后送公司进行测序。引物合成与测序均在武汉天一华煜基因科技有限公司完成。1.2.3生物信息学分析利用在线网站与数据库对 TaPAT1-2D 基因及其蛋白质进行分析,具体见表 1
22、。1.2.4TaPAT1-2D 基因的表达分析在 Ensemble Plants 数据库比较 TaPAT1-2D的同源基因序列,在其差异区域设计引物 qPCR-TaPAT1-2D-F/R 用于检测 TaPAT1-2D 的表达水平,以 Ta2291 作为内参基因21,所用引物为Ta2291-F/R(表 2)。利用 2 SYBR Green qPCRMaster Mix 试剂盒进行实时荧光定量 PCR(qRT-PCR),反应体系与程序参见说明书,每个反应 3次重复,采用 2 CT法计算基因相对表达水平。1.2.5亚细胞定位将重组质粒 pCAMBIA2300-TaPAT1-2D-GFP转至农杆菌感受
23、态细胞 GV3101,挑取阳性单克表 1生物信息学分析工具与数据库Table 1Tools and databases used in bioinformatics analysis名称 Name描述 Description网址 WebsiteSMART功能结构域 Functional domainhttp:/smart embl-hei-delberg de/GSDS基因结构 Structure of genehttp:/gsds gao-lab org/ProtParam理化性质 Physical and chemical propertieshttps:/web expasy org/p
24、rotparam/NetPhos磷酸化位点 Phosphorylation sitehttp:/www cbs dtu dk/services/NetPhos/ProtScale亲疏水性 Hydrophilicityhttps:/web expasy org/protscale/SOPMA二级结构 Secondary structurehttps:/npsa-prabi ibcp fr/cgi-bin/secpred_sopma plPlantCARE顺式元件 Cis-acting elementhttp:/bioinformatics psb ugent be/webtools/plantc
25、are/html/SignalP信号肽 Signal peptidehttps:/services healthtech dtu dk/service php?SignalP-5.0TMHMM跨膜区 Transmembrane areahttps:/services healthtech dtu dk/service php?TMHMM-2.0Softberry亚细胞定位 Subcellular localizationhttp:/www softberry com/Ensembl基因组 Genomehttps:/asia ensembl org/index html52董飞燕,等 小麦 Ta
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