新生儿高苯丙氨酸血症筛查及PAH基因变异和缺失分析_马翠霞.pdf
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1、 98 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 2 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.2 Feb.2023新生儿高苯丙氨酸血症筛查及 PAH 基因变异和缺失分析马翠霞1 封露露1 马倩倩2 李 扬3 封纪珍11.石家庄市妇幼保健院遗传科(河北石家庄 050051);2.石家庄市第四医院体检中心(河北石家庄 050000);3.石家庄市妇幼保健院产前诊断科(河北石家庄 050051)摘要:目的 了解石家庄市新生儿高苯丙氨酸血症(HPA)的发病率、临床分型以及相关基因的变异特征。方法 选择2017年3月至2021年5月在石家庄市新生儿疾病筛查中心进行HPA筛查的487 38
2、0名新生儿,经免疫荧光法检测其足跟血苯丙氨酸浓度,采用基因测序技术对可疑阳性患儿苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因进行检测,患儿父母采用Sanger法进行目标基因变异验证,进一步将基因测序结果与正常人比对,找出片段缺失区域并进行分析。结 果 487 380名新生儿中筛查出阳性儿191例,确诊HPA 104例,均为PAH缺乏症,发病率为1/4686。104例患儿中共检测出62种基因变异,包括错义变异37种、剪接变异10种、无义变异7种、同义变异2种、整码变异1种以及杂合缺失5种。PAH基因常见的变异位点有c.158GA(18.7%)、c.728GA(10.5%)、c.611AG(6.7%)、c.331
3、CT(4.8%)和c.721CT(4.8%),并发现未报道基因片段缺失(外显子6杂合缺失)及基因变异(c.630TG、c.61-1GA、c.912+5GT和c.1055+241CA)。结论 石家庄市HPA发病率较高,为1/4686;发现了62种PAH基因变异,包括5种片段缺失;此外发现5种未报道的基因变异,丰富了基因数据库。关键词:高苯丙氨酸血症;发病率;苯丙氨酸羟化酶;基因变异;新生儿 Screening of newborns with hyperphenylalaninemia and analysis of PAH gene mutation and deletion MA Cuixi
4、a1,Feng Lulu1,Ma Qianqian2,Li Yang3,Feng Jizhen1(1.Department of Heredity,Shijiazhuang Maternal And Child Health Care Hospital,Shijiazhuang 050051,Hebei,China;2.Medical Examination Center,The Fourth Hospital of Shijiazhuang,Shijiazhuang 050000,Hebei,China;3.Department of Prenatal Diagnosis,Shijiazhu
5、ang Maternal And Child Health Care Hospital,Shijiazhuang 050051,Hebei,China)Abstract:Objective To understand the incidence,clinical typing,and variant characteristics of related genes in neonates with hyperphenylalaninemia(HPA)in Shijiazhuang.Methods 487,380 newborns underwent HPA screening in Shiji
6、azhuang Disease Screening and Diagnosis Center from March 2017 to May 2021 were selected.The phenylalanine concentration in heel blood samples was detected by immunofluorescence,the phenylalanine hydroxylase(PAH)related genes of suspected positive children were detected by gene sequencing,and the ta
7、rget gene variants were verified by the Sanger sequencing in the parents of the children,and the results of gene sequencing were further compared with the normal people to fragment deletion regions.Results Among the 487,380 neonates,191 were screened positive and 104 were diagnosed as HPA,all with P
8、AH deficiency,with a prevalence of 1/4686.A total of 62 genetic variations were detected in 104 children,including 37 missense mutations,10 splice mutations,7 nonsense mutations,2 synonymous mutations,1 full code mutation and 5 heterozygous deletions.The most common variants of PAH gene are c.158GA(
9、18.7%),c.728GA(10.5%),c.611AG(6.7%),c.331CT(4.8%)and c.721CT(4.8%),and unreported gene fragment deletions(exon 6 heterozygous deletion)and gene variants(c.630TG,c.61-1GA,c.912+5GA)were found.Conclusions The prevalence of HPA in Shijiazhuang was high at 1/4686;62 PAH gene variants,including 5 fragmen
10、t deletions,were identified;in addition,5 unreported gene variants were found,which enriches the gene database.Key words:hyperphenylalaninemia;incidence rate;phenylalanine hydroxylase;gene mutation;newborndoi:10.12372/jcp.2023.21e1659 论 著 基金项目:河北省医学科学研究课题计划(No.20210689)通信作者:封纪珍 电子信箱: 99 临床儿科杂志 2023
11、年 第 41 卷第 2 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.2 Feb.2023高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia,HPA)主要是由苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)或其辅酶四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)缺乏引起的常染色体隐性遗传病,为最常见的一种氨基酸代谢障碍性疾病1。HPA在不同地区、不同人群间发病率有很大不同,相关PAH基因的变异位点也有很大差异。本研究通过分析石家庄市新生儿HPA筛查及患儿基因检测结果,了解石家庄市新生儿HPA发病及基因变异情况,完善石家庄HPA患儿的基因
12、突变谱,为进一步遗传咨询提供理论依据。1 对象与方法1.1 研究对象选择石家庄市新生儿疾病筛查中心负责的22个区县107所医疗机构2017年3月至2021年5月出生的新生儿495 740例。纳入标准:出生后320 d;充分哺乳(68次以上)后采集足跟血。排除标准:重复报告;数据不完整;死亡;失访。本研究获石家庄市妇幼保健院伦理委员会批准(No.202036),研究对象监护人签署知情同意书。1.2 方法1.2.1 足跟血采集方法 75%乙醇消毒,使用一次性采血针刺于足跟内或外侧,深度8 mm的血斑,自然晾干,置48 保存,每周定期送至筛查中心,筛查中心收到样本后于5个工作日内进行检测并出具可疑结
13、果。1.2.2 筛查方法及诊断标准 苯丙氨酸(Phe)测定采用免疫荧光法,试剂为芬兰Labsystems新生儿 Phe 浓度测定试剂盒,仪器为芬兰 Wallac 公司半自动VICTOR2D 1420 时间分辨荧光免疫分析仪。严格按照说明书进行检测。初筛及复查血Phe浓度2.0 mg/dL(120 mol/L)为阳性。筛查阳性者召回采血测定Phe浓度仍2.0 mg/dL,并且苯丙氨酸/酪氨酸(Phe/Tyr)2.0确诊为HPA;进行尿蝶呤谱分析以区分 PAH 缺乏症和 BH 4 缺乏症。患儿根据治疗前最高血 Phe 浓度分为经典型苯丙酮尿症(classic phenylketonuria,cPK
14、U,Phe 1 200 mol/L)、轻度PKU(mild phenylketonuria,mPKU,360 mol/LPhe1 200 mol/L)和轻度高苯丙氨酸血症(mild hyperphenylalaninemia,MHP,120 mol/LPhe360 mol/L)。1.2.3 PAH基因检测 采用基因测序技术对患儿及其父母PAH基因进行检测。患儿及其父母静脉血用乙二胺四乙酸抗凝后严格按照说明提取DNA,并对提取物进行质检,后进行基因组文库构建。标记探针与文库DNA杂交,用磁珠结合探针以抓取目的基因,磁珠被磁力架吸附洗脱纯化,目的基因得以富集,进而进行高通量测序。所有数据进行单核苷
15、酸序列多态性分析(single nucleotide polymorphisms,SNP),检测到的变异位点按照美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)指南进行致病性分析。未报道的新发变异使用MutationTaster、GERP+、SIFT、PolyPhen_2、REVEL等功能预测软件进行致病性预测。对发现的致病变异在其所在片段上、下游设计引物进行扩增及Sanger测序,进一步验证测序结果,采用Sanger法对患儿父母进行目标基因变异验证,基因测序相关工作由北京迈基诺医学检验所完成。1.3
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