布鲁氏菌鞭毛和毒力因子及疫苗研究进展.pdf
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1、动物医学进展,():P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e布鲁氏菌鞭毛和毒力因子及疫苗研究进展收稿日期:基金项目:国家现代农业产业技术体系资助项目(C A R S );西藏自治区 年自然科学基金项目(X Z Z R G)作者简介:常攀(),男,陕西礼泉人,兽医师,硕士研究生,主要从事高原动物传染病研究.通讯作者常攀,边巴央拉,索朗斯珠,罗润波,娄永志,辛娇娇,贡嘎(西藏农牧学院动物科学学院,西藏林芝 ;西藏自治区动物疫病预防控制中心,西藏拉萨 )摘要:布鲁氏菌病是一种重要的人兽共患病,在全球范围内造成了巨大的经济损失和公共卫生
2、问题.近年来,我国布鲁氏菌病仍没有得到很好的控制,目前尚无国际上认可的人用布鲁氏菌疫苗,动物布鲁氏菌疫苗在近几十年布鲁氏菌病防控中起着重要作用,但仍存在一些不足.论文综述了布鲁氏菌鞭毛的组成结构和鞭毛蛋白的作用与功能、毒力因子和疫苗研发等方面的研究进展,为后续布鲁氏菌致病性的分子机制研究和疫苗研发提供参考.关键词:布鲁氏菌;鞭毛结构和作用;鞭毛蛋白;毒力因子;免疫逃避;疫苗研发中图分类号:S 文献标识码:A文章编号:()布鲁氏菌是一种球杆状的革兰氏阴性兼性细胞内细菌,引起的人兽共患布鲁氏菌病(简称“布病”)在全球范围造成了巨大的经济损失和公共卫生问题.感染后主要症状是发热、流汗和关节疼痛,常导
3、致动物胎儿流产和人类似流感症状,伴有波状热,慢性感染会引起肝损伤、睾丸炎、心内膜炎和关节炎等并发症.人通常通过接触受感染动物的胎盘、体液,食用受污染的牛乳和乳制品,或吸入受污染的气溶胶感染布鲁氏菌.年,兰州发生的布鲁氏菌抗体阳性人数超过 人.近年来,我国布鲁氏菌病仍没有得到很好的控制,需要引起高度重视.由于其感染剂量低且易于以气溶胶形式传播,布鲁氏菌是最早被考虑用作生物武器的微生物之一 .布鲁氏菌于 年被大卫布鲁斯发现.年世界卫生组织将布鲁氏菌属(B r u c e l l a)分为个经典种,包括羊种布鲁氏菌(Bm e l i t e n s i s)、牛种布鲁氏菌(Ba b o r t u
4、s)、猪种布鲁氏菌(Bs u i s)、犬种布鲁氏菌(Bc a n i s)、绵羊附睾种布鲁氏菌(Bo v i s)、沙林鼠种布鲁氏菌(Bn e o t o m a e).Bm e l i t e n s i s、Ba b o r t u s和Bs u i s常引起小反刍动物、牛和猪的布鲁氏菌病,也是引起人布鲁氏菌病最常见的病原体.Bm e l i t e n s i s致病力最强,通常通过宿主小反刍动物将布鲁氏菌传播给人.近年来陆续从海洋哺乳动物中分离获得了新的种型.年,布鲁氏菌属种群扩大到包括从海洋哺 乳 动 物 中 分 离 出 来 的 鲸 类 海 洋 布 鲁 氏 菌(Bc e t i)和
5、鳍足类海洋布鲁氏菌(Bp i n n i p e d i a l i s).布鲁氏菌根据嗜性、致病性和宿主表型特征的不同,目前共包括 个种.大规模基因测序等新技术被用于对具有布鲁氏菌属特征的生物进行分组.鞭毛是布鲁氏菌重要的毒力因子,部分鞭毛蛋白参与细菌在宿主中复制和长期感染的机制.有些鞭毛毒力蛋白已在小鼠模型中作为免疫原剂,用于开发布鲁氏菌病疫苗.本文对布鲁氏菌鞭毛的组成结构和作用、鞭毛蛋白的功能,主要的毒力因子和疫苗研究进展等方面内容进行综述,对今后布鲁氏菌鞭毛致病的分子机制的深入研究和疫苗研发等方面提供参考.布鲁氏菌鞭毛鞭毛结构布鲁氏 菌 鞭 毛 由 大 约 种 蛋 白 质 组 成 的
6、个蛋白质亚单位构成.鞭毛结构由基体、细丝和钩子个部分组成,.基体作为旋转马达,细丝作为螺旋桨推动器,钩子作为将细丝连接到马达的接头.细胞质膜蛋白M o t A和M o t B组成定子复合体,将能量转换为马达的旋转.鞭毛马达将细胞膜上阳离子的电化学电位差转换为高速旋转所需的机械功,效率几乎为 ,最高转速为 r/s.基体由L P环、M S环、C环和杆组成.其中M S环和C充当鞭毛马达的转子.L P环充当衬套、减少摩擦,支持远端杆快速稳定的旋转,.用冷冻电镜描述杆周围的L P环结构,显示该结构为 倍旋转对称,每个亚基与个复杂亚基间相互作用.M S环由核心跨膜蛋白F l i F组成,是转子的核心和鞭毛
7、组装的初始模板.C环由F l i G、F l i M和F l i N种细胞质蛋白组成,附着在M S环的细胞质表面,对马达的扭矩产生和开关调节至关重要.细丝是直径约 n m的螺旋结构,长约 n m,由大约 个鞭毛蛋白(F l i C)亚基组成.它充当坚硬的螺旋,为细菌在水环境中的运动产生推力.细丝在顶端以C a p蛋白(F l i D)结束,该蛋白形成星形同源五聚体,覆盖细丝的开口端并帮助F l i C蛋白的组装,.F l i D是鞭毛素体外聚合的抑制剂,也是鞭毛素体内生长所必需的.杆是一个长约 n m刚性的直的圆柱形结构,与M S环相连充当驱动轴,通过钩子将马达扭矩传输到细丝.杆分为两个结构部
8、分,由F l i E、F l g B、F l g C和F l g F组成的近端杆和F l g G形成的远端杆.F l g G蛋白对布鲁氏菌毒力有很大作用,有助于细菌的感染性和适应性,f l g J基因缺失细菌无法建立感染和鞭毛组装.钩子是一个长约 n m的短而弯曲片段,由鞭毛蛋白(F l g E)的螺旋亚基组成,并充当通用的关节结构将运动传递给细丝.在细丝和钩子之间,有一个较薄、更光滑的短轴向结构段,称为钩子和细丝连结,由适配器蛋白F l g K和F l g L构成.通过透射电子显微镜对Bm e l i t e n s i s鞭毛结构进行分析,已发现鞭毛鞘的几个特征.Bm e l i t e
9、n s i s可见鞭毛直径 n m,比无鞘鞭毛的直径大.细菌细丝的直径通常约 n m,但Bm e l i t e n s i s鞘内的细丝直径只有 n m.Bm e l i t e n s i s鞘的产生与的鞭毛组装无关,因为细菌结构鞭毛蛋白的突变体(f l i F、f l g E和 f l i C)中没有F l g E或F l i C蛋白,但仍会产生丝状附属物.研究发现Bm e l i t e n s i s的鞭毛调节由F t c R鞭毛主调节器控制,该调节器通过直接与f l i F启动子结合来激活鞭毛表达.Bm e l i t e n s i s的鞭毛鞘是含有L P S的外膜延伸,这也存在
10、于幽门螺杆菌、拟杆菌属和一些弧菌物种中.鞭毛结构的构象过程已在大肠埃希氏菌和沙门氏菌中得到广泛研究.这是一个受调控的过程,与鞭毛形成顺序密切相关的基因(、和类基因)被激活有关,.F l h D C是一种主调节剂,存在于大肠埃希氏菌和沙门氏菌中,控制类基因的表达.这些基因的产物是结构蛋白,分别作为F l i F和F l g E构成基体和钩子.大肠埃希氏菌中这些类蛋白的调节因子是F l i A(一种s i g m a因子,也称为 )和F l g M(a n t i s i g m a).一旦钩子的结构完成,F l g M蛋白就会通过其通道分泌,使得 可以激活包括F l i C在内的类基因的表达,从
11、而结束细丝的形成.鞭毛表达的分子机制布鲁氏菌鞭毛蛋白最终进入受感染宿主细胞的细胞质,并刺激炎症小体介导的炎症反应,这对布鲁氏菌的复制很重要.鞭毛是一种重要的毒力因子,它使布鲁氏菌能够微调宿主免疫反应,从而促进慢性感染的建立和维持.与其他一些革兰氏阴性菌的鞭毛不同,布鲁氏菌鞭毛蛋白不被T L R 识别,这导致了布鲁氏菌感染的隐秘性.带鞘鞭毛在细菌中相对罕见,研究表明它们在外膜囊泡(OMV)的释放中发挥作用.布鲁氏菌鞭毛生物合成的基因是分阶段表达的,协调这些基因有序表达的网络与其他细菌中发现的不同.群体感应调节剂V j b R和B a b R、光敏调节剂L o v h K、一般应激反应调节剂R p
12、 o E 和循环d i GMP介导的信号传导也控制布鲁氏菌中鞭毛基因的表达 .利用鞭毛运动的细菌几乎普遍具有趋化基因,使它们能够控制鞭毛旋转的方向以响应环境刺激,这使它们能够游向营养物质并远离有毒化合物,.缺乏鞭毛生物合成基因的Bo v i s突变体在小鼠中具有完全毒性,这表明鞭毛对发病机制的贡献可能是宿主依赖性的.虽然布鲁氏菌基因组中包含鞭毛操纵子,但没有证据表明其运动性.在特定条件下,Bm e l i t e n s i s是非运动性的,它能够通过某种机制形成鞭毛附属物.有研究从青蛙中分离出布鲁氏菌菌株表现出高运动性的表型.通过对非运动性布鲁氏菌基因组测序,发现非功能性鞭毛基因的存在,而对
13、运动性菌株B 中编码鞭毛蛋白的基因分析表明,所有基因功能都齐全,可能是这些基因在环境选择下表达的.某些细菌酶也间接地参与,实现复制生态位的目的.例如,布鲁氏菌硝酸还原酶,它在有氧条件下基本表达,但在缺氧条件下表达增加.这种酶与其他蛋白质一起,如超氧化物歧化铜锌酶(S O DC u/Z n),对感染期可能影响细菌消融的氧化还原变化具有适应功能.当布鲁氏菌在受感染的哺乳动物子宫等器官繁殖时,对细菌的存活有重要影响.在这种情况下,活 性 氧(R O S)增 加 激 活 某 些 蛋 白 质,如Bm e l i t e n s i s、Bs u i s和Ba b o r t u s中的M u c R,这
14、些蛋白质也参与激活鞭毛基因的表达以应对环境压力.M u c R蛋白与Bc a n i s的热应激、铁限制和对各种抗生素的抗性有关,m u c R突变株中各种细菌鞭毛相关基因的表达水平发生了改变,M u c R蛋白的缺失显著影响了R AW 巨噬细胞和小鼠感染常攀等:布鲁氏菌鞭毛和毒力因子及疫苗研究进展模型中的布鲁氏菌毒力.某些蛋白质也参与鞭毛基 因 的 级 联 调 节,如 编 码s i g m a因 子 的 基 因R p o D、R p o N、R p o H、R p o H、R p o E 和R p o E,R p o E 基因的缺失使鞭毛蛋白F l g E的表达增加.此外,变异株也增加f l
15、 i F、f l g E、f l i C、f l a F和f l b T基因的表达(表),这些基因的表达同样受到主调节器f t c R的调控,f t c R同样也受到r p o E 基因产物和某些未知蛋白的调控,在某些情况下它们被描述为假基因,尚未被研究.表鞭毛蛋白的基因编码T a b l eG e n e se n c o d i n go f f l a g e l l i n鞭毛结构F l a g e l l a r s t r u c t u r e蛋白P r o t e i n功能F u n c t i o n基因编码G e n ec o d e位置L o c a t i o n参考
16、R e f e r e n c eC a p D(F l i D)与粘蛋白粘连B A B 细丝远端K e g g数据库细丝F i l a m e n tF l i C细丝亚单位,免疫B A B 细丝 F l g L将鞭毛附着在钩上B A B 外部OM F l g KB A B 外部OM 钩子H o o kF l g E钩蛋白B A B 外部OM F l g H形成L 环的结构蛋白B A B 外部OM F l g I构成P环的结构蛋白B A B 肽聚糖F l g G构成通道的结构蛋白B A B 外膜/肽聚糖 杆R o dF l g FB A B F l g CB A B F l g BB A B
17、 F l i EB A B M o t E转子稳定蛋白未知膜间间隙外部出口门位置E x t e r n a l p o s i t i o ne x p o r tg a t eM o t CB A B 膜间间隙 M o t A未知膜间间隙M o t BB A B (肽聚糖,内膜)F l i L连接M o t结构与M S环假基因(肽聚糖,内膜)M S环M S r i n gF l i F构成M S环的结构蛋白B A B 内膜(M S环)F l i G形成C环的结构蛋白假基因细胞质F l i M假基因细胞质C环C r i n gF l i NB A B 细胞质 F l i H/F l i I/F
18、 l i J出口处的鞭毛蛋白;稳定C环假基因细胞质F l i O构成出口门的结构蛋白,型分泌物导出器假基因内膜F l i PB A B F l i QB A B 出口门E x p o r tg a t eF l i RB A B F l h AB A B ,B A B F l h BB A B F t c R转录调控因子B A B 细胞质F l a F转录调控因子B A B 细胞质调节基因R e g u l a t o r g e n e sF l b T转录调控因子B A B 细胞质F l i K一种控制钩长的分子尺假基因细胞质F l g D钩子的盖子折叠B A B 细胞质F l g NF
19、l g K的分子伴侣假基因细胞质F l g AF l g I的分子伴侣B A B 细胞质f l i RF l i R的生物合成B A B 细菌输出蛋白注:“”在布鲁氏菌中尚未鉴定;OM外膜;P G肽聚糖;I M内膜;P S 周质间隙.N o t e:I th a sn o tb e e n i d e n t i f i e d i nB r u c e l l a;OM O u t e rm e m b r a n e;P GP e p t i d o g l y c a n;I MI n n e rm e m b r a n e;P S P e r i p l a s m i cs p a
20、 c e 布鲁氏菌毒力因子毒力因子是病原体产生的有利于其感染能力的分子,使它们能够在宿主中繁殖,逃避宿主免疫反应并获得营养.布鲁氏菌最重要的特征是能够在吞噬细胞和非吞噬细胞内存活和复制.布鲁氏菌的主要毒力 因 子 还 含 有 脂 多 糖(L P S)、型 分 泌 系 统动物医学进展 年第 卷第期(总第 期)(T S S)、外膜蛋白和外膜脂蛋白、环,葡聚糖(C y c l i c,G l u c a n s,CG)和磷脂酰胆碱(P C)等.这些毒力因子在布鲁氏菌的感染、复制和免疫逃避机制中发挥重要作用.脂多糖脂多糖由多糖O链、核心和脂质A组成,是革兰氏阴性菌重要的细胞膜成分之一,在维持其细胞膜完
21、整性方面发挥着重要作用.Bo v i s和Bc a n i s由于缺乏O链,产生粗糙型L P S,其他布鲁氏菌产生光滑型L P S.O链对光滑布鲁氏菌菌株的毒力非常重要,一种方法是保护光滑型布鲁氏菌株免受补体和它们与宿主吞噬细胞相互作用时遇到的抗菌肽的侵害,另一种是作为粘附素.O链介导的光滑布鲁氏菌的摄取在免疫逃避机制中也起着重要作用,因为这种进入途径会刺激巨噬细胞和树突状细胞中低水平的促炎细胞因子产生.O链介导的光滑布鲁氏菌菌株进入巨噬细胞导致毒力的另一种方式是抑制这些吞噬细胞中半胱天冬酶介导的细胞凋亡.这种抑制背后的确切机制尚未明确,但光滑菌株延长巨噬细胞寿命的能力,可能会增强它们避免免疫
22、清除和传播到哺乳动物宿主不同器官的能力.在疫苗接种或自然感染布鲁氏菌后会自然产生O多糖(O P S)抗体,血清杀菌活性(S B A)测定表明,接种疫苗或自然感染后的布鲁氏菌O P S血清抗体可以在体外杀死布鲁氏菌,为今后开发布鲁氏菌O P S疫苗提供了思路.脂质A被称为“内毒素”,它是L P S的成分,被宿主模式识别受体T L R 识别,并且许多革兰氏阴性菌的脂质A会诱导强烈的炎症反应.布鲁氏菌脂质A还诱导人中性粒细胞过早凋亡.凋亡的中性粒细胞内携带布鲁氏菌,通过不刺激炎症反应的机制,被巨噬细胞和树突状细胞吞噬,这可能是布鲁氏菌在感染初期避免被宿主免疫系统识别的另一种策略.L P S核心主要作
23、为O链和脂质A之间的结构连接.研究表明L P S核心在细菌逃避宿主免疫反应的过程中起着重要作用.布鲁氏菌产生的核心结构含有一个横向的寡糖侧链,该侧链在空间上保护脂质A并抑制其与宿主巨噬细胞和树突状细胞上的T L R 的结合.这种侧链赋予L P S核心正电荷,对光滑型和粗糙型布鲁氏菌对补体和杀菌肽杀伤的抗性都很重要.一些在L P S产生过程中起辅助作用的基因产物已被发现,它们对布鲁氏菌的毒力很重要.Ba b o r t u s中b a k和r o mA突变体产生的L P S具有改变的O链水平,并且两种突变体在小鼠中都表现出显著的衰减.R o mA是一种周质蛋白,被认为可以稳定L P S生物合成复
24、合物的成分.B A K是凝集素样蛋白,但尚未确定它在调节L P SO链含量方面的确切作用.L p s A是一种糖基转移酶,参与L P S的 生 物 合 成.通 过 试 验 构 建 感 染 布 鲁 氏 菌M 的 小 鼠 巨 噬 细 胞 的l p s A突 变 株(M l p s A)和互补株(M l p s A C)来检测细胞焦亡,发现l p s A基因的失活削弱了L P S在布鲁氏菌突变体感染期间获得细胞质的能力,并降低了布鲁氏菌的存活率.表明布鲁氏菌l p s A通过抑制L P S诱导的非典型细胞焦亡途径在先天免疫和炎症反应中发挥部分作用.型分泌系统T S S是布鲁氏菌重要的毒力因子,帮助布
25、鲁氏菌逃避宿主的免疫系统,促进布鲁氏菌在宿主细胞中的复制和持续感染.T S S以v i r B操纵子为代表,由 种 蛋 白 质 组 成,其 中种 构 成 转 运 体(V i r B、V i r B,V i r B 到V i r B )的核心、种为驱动效应分泌提供能量的AT P酶(V i r B 和V i r B )和种在T S S组装过程中重塑细菌细胞肽聚糖层的裂解转糖酶(V i r B).T S S由V i r B操纵子编码,该操作子在不同布鲁氏菌株中高度保守.协助组装和发挥T S S功能的布鲁氏菌蛋白也是v i r B操作子之外的基因编码,.V i r J蛋白的确切功能尚不清楚,有研究表明
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