BBR联合ADSCs移植对...疗作用与保护胰岛的机制研究_田晋明.pdf
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1、 基金项目:辽宁省教育厅自然科学基金委员会重点项目,项目编号:。作者简介:田晋明(),男,重庆人,在读硕士研究生,主要研究方向为干细胞与糖尿病的治疗。通讯作者:杨静娴(),女,辽宁大连人,教授,博士学位,主要研究方向为干细胞与组织再生技术。联合 移植对糖尿病小鼠的治疗作用与保护胰岛的机制研究田晋明,赵宇萌,李贺,田雨,杨静娴(辽宁中医药大学药学院,辽宁 大连)摘要:目的 探究黄连素(,)联合脂肪间充质干细胞(,)对糖尿病(,)小鼠的治疗效果以及对胰岛细胞的保护作用与机制。方法通过一次性腹腔注射链脲佐菌素()建立 小鼠模型。将成模的小鼠随机分为模型组、组、组、联合组(联合),另取正常小鼠做对照组
2、,每组 只,相应治疗 。观察血糖和糖耐量的变化,并计算糖耐量曲线下面积(,);酶联免疫吸附实验(,)检测小鼠血清内肿瘤坏死因子(,)、干扰素(,)的水平;苏木精伊红(,)染色检测小鼠胰岛的病理损伤情况;免疫荧光法检测小鼠胰岛 细胞凋亡;免疫组化以及 法检测小鼠胰腺组织 样受体 (,)、髓样分化初反应蛋白 (,)、核因子 (,)、蛋白与 的表达。结果与模型组、组或 组比较,联合组小鼠血糖及糖耐量降低,血清、含量减少,胰岛病理损伤减轻,细胞凋亡数减少,胰腺组织、蛋白与 的表达降低。结论 与 移植联合治疗可通过抑制 信号通路减轻 小鼠机体炎症反应与胰岛的病理损伤,对 小鼠有一定治疗作用,且其效果好于
3、单用 或 治疗。关键词:脂肪间充质干细胞;糖尿病;黄连素;胰岛中图分类号:文献标志码:文章编号:(),(,):()()()(),(),();()()();();,锦州医科大学学报 ()DOI:10.13847/ki.lnmu.2023.01.022 :;糖尿病()是一种以高血糖为主要症状的免疫和代谢性疾病,常见类型为 型糖尿病(,)、型糖尿病(,)。胰岛细胞的自身免疫性炎症是两种类型 的重要病理生理机制之一,胰岛的长期炎症诱导胰岛 细胞损伤,将加重 的进程。样受体 (),髓样分化初反应蛋白 ()、核因子 ()是经典的促炎通路,多项研究表明,在 的发生发展过程中,该通路中的相关蛋白表达增加,在体
4、内 和配体结合能引起、的级联反应,从而促使炎症因子表达与释放,引起并加重胰岛 细胞损伤。间 充 质 干 细 胞(,)有强大的免疫调节功能,其能通过旁分泌免疫调节因子起到减轻炎症,促进组织修复的作用,有从根源治疗 的潜力。但多项研究表明,输注治疗 的疗效受患者体内的高血糖、炎症等不良微环境影响。因此改善 患者体内的不良微环境是提高 移植治疗效果的有效途径。黄连素()产自于黄连,是黄连发挥降血糖效果的主要药效成分,同样能减少 患者机体炎症因子与终末糖基化产物的生成,改善胰岛素抵抗和内质网应激,具有抗氧化、降血糖、保护胰岛 细胞的作用。此外已有研究报道 有促进 分泌营养因子、抑制 凋亡的效果,对 存
5、活有积极作用。我们推测将 与 联合使用可能会提高 对 的治疗效果。因此本研究采用 联合 移植治疗,通过对 小鼠的血糖、糖耐量检测,观察两者联用对 的治疗效果,利用、病理染色、等方法探讨联合治疗对 小鼠胰岛细胞的保护作用及可能机制,阐明 对 的增效作用。材 料 实验动物 级昆明种雄性小鼠,体质量(),购自辽宁长生生物科技有限公司;许可证号:()。饲养于指定的动物护理室,温度:();湿度:(),自由饮食饮水。小鼠适应性饲养 后用于实验。本研究经辽宁中医药大学动物伦理委员会批准后进行,许可证号:()。主要试剂小鼠脂肪间充质干细胞()(赛业生物科技有限公司,批号:),链脲佐菌素(,)(北京索莱宝科技有
6、限公司,批号:),培养基(,批号:),胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司,批号:),盐酸小檗碱()(上海麦克林生化科技有限公司,批号:),、酶联免疫试剂盒(上海 科 兴 生 物 科 技 有 限 公 司,批 号 分 别 为:、),染色试剂盒,一抗(上海碧云天生物技术有限公司,批号分别为:、),、兔抗小鼠一抗,标记的抗兔、标记的兔抗小鼠二抗(沈阳 万 类 生 物 技 术 有 限 公 司,批 号 分 别 为:、),羊抗兔()二抗、显色试剂盒(北京索莱宝生物技术有限 公 司,批 号 分 别 为:,),(公司,批号:),合成试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,批号:),(上海碧云天生物技术有限公司,
7、批号:)。主要仪器培养箱(北京东联哈尔仪器制造有限公司,中国,型号 型),恒温冷冻切片机(赛 默 飞 世 尔 科 技 有 限 公 司,美 国,型 号:型),荧光显微镜(尼康公司,日本,型号:型),血糖仪(三诺生物传感股份有限公司,型号:型),酶标仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司,型号:型),实时定量 仪(美国 公司,型号:型)。方 法 造模、分组与给药小鼠适应性喂养 后。禁食不禁水 ,一次性腹腔注射 ()溶液构建 模锦州医科大学学报 年 月,()型,造模 后恢复进食。于造模后第、第 天行剪尾采血检测血糖。连续两次随机血糖 ,确定为 模型。将成模的 只 小鼠随机分为模型组、组、组、联合组,每
8、组 只,另取 只正常小鼠作为对照组。自成模日开始,组以及联合组,灌胃给予 的,每日 次,连续 ,对照组、模型组、组分别灌胃给予等体积生理盐水;初次灌胃给药次日,组、联合组尾静脉注射 总量为 个小鼠 悬液,对照组、模型组、组小鼠尾静脉注射等量的。小鼠的血糖和糖耐量检测从给予 当天开始,测定给药后第、第、第、第 天小鼠随机血糖,于第 天禁食 后进行空腹糖耐量测试,即灌胃给予小鼠葡萄糖 ,测量、血糖值,并计算曲线下面积(,)。法检测 小鼠血清炎症因子的含量实验结束后对小鼠行眼眶取血,离心 获取血清,采用 试剂盒测定血清 和 的含量,具体操作步骤依照试剂盒说明书进行。小鼠胰腺组织切片病理学分析采血后处
9、死小鼠,取出胰腺组织,多聚甲醛固定,蔗糖脱水,包埋,进行冰冻切片。染色,观察小鼠胰腺组织病理损伤情况;免疫荧光(抗 和抗 )染色,复染,计算 面积与 细胞数;免疫组织化学(抗、)染色,苏木素复染,计算胰岛平均光密度值(胰岛的光密度值累加起来得到的 值与胰岛的面积 的比值)。以上实验分别保持相同条件拍照,所得图片采用 软件分析。实时荧光 检测小鼠胰腺组织、的表达给药结束后,收集各组小鼠胰腺组织,加入 试剂提取总,检测完 浓度和完整性后按试剂盒说明逆转录成,反应条件为:,个循环。内参基因选用,使用 法计算基因的相对表达量,见表。表 引物序列基因名上游引物序列()下游引物序列()统计学方法实验数据以
10、表示,结果采用 软件进行统计分析,血糖、糖耐量数据多组间不同时间点比较采用重复测量双因素方差分析()结合 检验,其他数据多组间比较采用单因素方差分析(),以 为差异具有统计学意义。结 果 小鼠血糖给予 联合 治疗后,于第、第、第、第 天检测小鼠随机血糖,结果发现,随着病程延长,模型组小鼠血糖持续升高,与对照组比较有显著差异();与模型组比较,组、组、联合组小鼠血糖明显降低(),其中 组、组小鼠血糖在第 天后又逐渐回升;而联合组小鼠血糖持续下降,与 组或 组比较有显著差异(),见表。提示 联合 治疗能降低 小鼠血糖,提高 的降血糖效果。小鼠糖耐量经过治疗后,对小鼠进行空腹糖耐量测试。结果显示,模
11、型组小鼠在灌胃葡萄糖溶液 后的血糖及 较对照组明显升高();经治疗后,与模型组比较,组、组、联合组小鼠在灌胃葡萄糖溶液 后的血糖及 均出现明显下降(或 );其中联合组小鼠灌胃葡萄糖溶液 后的血糖及 降低更显田晋明,等:联合 移植对糖尿病小鼠的治疗作用与保护胰岛的机制研究著,后血糖接近测试前水平,与 组或 组比较有显著性差异(或 ),见表。提示 联合 治疗能增强 改善 小鼠糖耐量的能力。表 联合治疗对 小鼠血糖的影响(,)组别血糖浓度()初始第 天第 天第 天第 天对照组 模型组 组 组 联合组 注:与对照组比较,;与模型组比较,;与 比较,;与 组比较,表 联合治疗对 小鼠糖耐量的影响(,)组
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