6-戊基-2H-吡喃-2-...菌活性及其对病害的防治效果_刘曼.pdf
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1、研究论文doi:10.16801/j.issn.1008-7303.2022.01226-戊基-2H-吡喃-2-酮对草坪币斑病菌的抑菌活性及其对病害的防治效果刘曼,牛启尘,尹淑霞*,王子玥(北京林业大学草业与草原学院,北京100083)摘 要:由 Clarireediaspp.引起的草坪币斑病是对草坪最具有破坏性的病害之一,6-戊基-2H-吡喃(6-pentyl-2H-pyran-2-one,6PP)是木霉菌属(Trichodermaspp.)重要的抗菌次生代谢产物。为探究 6PP 对草坪币斑病菌的抑菌活性、防治效果以及草坪币斑病菌对 6PP 的生理响应,本研究采用菌丝生长速率法测定了 6PP
2、 对草坪币斑病菌的抑制活性,分别采用室内离体叶片和盆栽试验测定了 6PP 对草坪币斑病的预防和治疗作用,并分析了在 6PP 影响下草坪币斑病菌菌丝结构及抗逆相关酶活性的变化。结果显示,6PP 对两种草坪币斑病菌 C.jacksonii 和 C.monteithiana均具有高抑制活性,其中对 C.monteithiana 的平均有效抑制中浓度(EC50)为 0.37g/mL,对C.jacksonii 的 EC50值为 0.04g/mL;经 6PP 处理后,C.jacksonii 和 C.monteithiana 菌丝生长异常,细胞膜通透性增加,相对电导率上升,细胞膜脂过氧化,细胞膜受损;C.j
3、acksonii 过氧化物酶(POD)的活性显著上升,但 pH 值不变,而 C.monteithiana 超氧化物歧化酶(SOD)活性、pH 值和胞外多糖(EPS)显著上升。1g/mL 的 6PP 在离体条件下对币斑病的预防效果为91.14%;盆栽条件下,防治效果为 72.21%。6PP 对草坪币斑病菌抑制作用显著,且在离体和盆栽条件下对病害均有良好的防治效果,具备开发成生态友好型杀菌剂的潜力。关键词:草坪币斑病菌;6-戊基-2H-吡喃;抑菌活性;草坪币斑病;防治效果;病原生理响应中图分类号:S482.7;TQ458文献标志码:AInhibitory activity of 6-pentyl-
4、2H-pyran-2-one against thepathogenesis fungi of dollar spot and its control efficacyLIUMan,NIUQichen,YINShuxia*,WANGZiyue(School of Grassland Science,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)Abstract:Turfdollarspot,causedbyClarireediaspp.,isoneofthemostdestructivefungaldiseasesonturf.6-Penty
5、l-2H-pyran-2-one(6PP)isacriticalantifungalsecondarymetaboliteproducedbyTrichodermaspp.Inordertoexploretheantifungalactivityof6PPagainstClarireediaspp.anditscontrolefficacytoTurfdollarspot,theinhibitionactivityof6PPonClarireediaspp.wasmeasuredby收稿日期:2022-03-18;录用日期:2022-10-11;网络首发日期:2022-10-14.Receiv
6、ed:March18,2022;Accepted:October11,2022;Published online:October14,2022.URL:https:/doi.org/10.16801/j.issn.1008-7303.2022.0122http:/ Journal of Pesticide ScienceE-mail:mycelialgrowthratemethod,andtheprotectiveandcurativeactivitiesof6PPagainstthediseasewasmeasuredondetachedleavesandpottedplants.Thech
7、angesinmycelialstructureandactivitiesofstressresistancerelatedenzymeofthepathogensunder6PPtreatmentwereanalyzed.Theresultsshowedthat6PPhadefficientinhibitionactivityonC.jacksoniiandC.monteithiana.Theaverageeffectiveinhibitorymediumconcentration(EC50)of6PPtoC.monteithianawas0.37g/mL,andtheaverageEC50
8、valuetoC.jacksoniiwas0.04g/mL.Afterbeingtreatedwith6PP,mycelialofbothC.jacksoniiandC.monteithianagrewabnormally,cellmembranepermeabilityandrelativeconductivityaswellasperoxidatedcellmembraneincreased.Theperoxidase(POD)activityofC.jacksoniiincreasedsignificantlyalthoughitspHremainedunchanged,whilethe
9、superoxidedismutase(SOD)activity,pHandexopolysaccharides(EPS)ofC.monteithianaincreasedsignificantly.Thepreventiveeffectsof1g/mL6PPondollarspotwere91.14%in vitroand72.21%inpots.6PPhasasignificantinhibitoryeffectonTurfdollarspotandhasagoodcontrolefficacyonthediseasein vitroandinpots.Thestudyrevealedth
10、epotentialof6PPtobeaneco-friendlyfungicidepreventingTurfdollarspot.Keywords:Clarireedia spp.;6-pentyl-2H-pyran-2-one;antifungalactivity;Turfdollarspot;controlefficacy;pathogenphysiologicalresponse草坪币斑病是温带地区精细化养护草坪上最严重的真菌性病害之一。研究显示,草坪币斑病的致病菌为 Clarireedia 属真菌,共有 6 个种,其中 C.jacksonii 和 C.monteithiana 在世
11、界范围内分布广泛,其寄主范围广,几乎能侵染所有的草坪草1-2。近年来,广泛使用多菌灵、二甲酰亚胺、脱甲基抑制剂(DMI)和琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)等化学杀菌剂保护草坪草免受草坪币斑病菌侵害,但已有文献表明,币斑病菌株对上述杀菌剂均产生了不同程度的抗性3-5。此外,化学杀菌剂可能通过地表径流和土壤入渗进入地下水,对环境、动物以及人类健康产生危害6-7,因此亟需开发绿色、安全、高效的新型杀菌剂防治草坪币斑病。自 20 世纪 30 年代以来,木霉菌 Trichodermaspp.以其优良的抑菌效果引起了研究学者们的广泛关注8-10。木霉菌具有对环境友好、病菌不易产生抗药性等优点,但在实际生产应
12、用中易受立地条件影响,导致田间防治时存在防治效果不稳定的问题11-12。木霉菌次生代谢物与木霉菌的生物活性功能密切相关13-14。研究表明,木霉菌代谢产物可以激活葡萄藤对霜霉病病原菌 Plasmoparaviticola 的防御机制15。康宁木霉 T.koningii 和哈茨木霉 T.harzianum 产生的哈茨酮内酯具有抗真菌活性和调节植物生长的双重作用16。木霉菌产生的可溶性代谢物对由 Colletotrichum falcatum 引起的甘蔗红腐病表现出良好的生防效果,且在大田条件下防治效果依然高效稳定17。使用人工合成或提取的木霉菌抑菌代谢物代替木霉菌防治植物病害,可以减少活体微生物
13、在田间使用过程中出现的效果不稳定的问题,同时兼具利用木霉菌活体生物防治病害的优势。6-戊基-2H-吡喃-2-酮(6-pentyl-2H-pyran-2-one,以下简称 6PP,结构式见图式 1)于 1972 年在绿色木霉 T.viride 中首次发现并分离提纯。它是一种无毒的、具有椰子香味的不饱和内酯,能从多种木霉菌的培养物中分离得到,包括橘绿木霉T.citrinoviride、哈茨木霉、康宁木霉、深绿木霉T.atroviride 和绿色木霉 T.viride。6PP 具有广谱性抗真菌活性,对菜豆大斑病菌 Macrophominaphaseolina、立枯丝核菌 Rhizoctonia so
14、lani、罗氏菌核 Sclerotium rolfsii、尖孢镰刀菌 Fusariumoxysporum、辣椒疫霉 Phytophthora capsica 和甜瓜疫霉 P.melonis 具有良好的抑菌作用,极具应用潜力18-21。目前尚未见有关利用 6PP 防治草坪币斑病的相关报道,其抑菌活性、防治效果和机理有待验证和探索。本文研究了 6PP 对 2 种草坪币斑病菌的抑菌活性和防治效果,并通过一系列生理生化指标的测定,探究 6PP 对草坪币斑病菌的抑菌活性以及对病害的防治效果,旨在为草坪币斑病的低毒科学防治提供参考。No.1刘曼等:6-戊基-2H-吡喃-2-酮对草坪币斑病菌的抑菌活性及其对
15、病害的防治效果105 1 材料与方法 1.1 供试材料供试菌株来自北京林业大学草地保护实验室,菌株编号为 N8、N13、N14、N18、73 和 112,其中 N8、73、112 为 Clarireedia jacksonii,N13、N14、N18 为 C.monteithiana;供试草坪草为匍匐翦股颖 A4Agrostis stoloniferaL.A4。基本培养基(MM):10g 葡萄糖、1.5gK2HPO4、2gKH2PO4、1g(NH4)2SO4、0.5gMgSO47H2O、2g 酵母提取物、15g 琼脂粉加去离子水定容到1L,灭菌;马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB):20g 葡萄糖
16、、6g 马铃薯浸粉加去离子水定容到1L,灭菌。6PP购自北京迈瑞达科技有限公司,纯度为 97%。1.2 仪器DZF-6020MBE 真空干燥箱(上海博讯有限公司);DL-CJ-2NDI 型超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司;SX700 高压灭菌锅(天美科学仪器有限公司);SPX 型智能生化培养箱(宁波江南仪器厂);DDSJ-318 型电导率仪(北京扬海伟业科技公司);FE28pH 计(大连贝尔分析仪器有限公司);岛津 UV-2600i 型紫外线分光光度计(上海滴冠有限公司);MultifugeX1R型高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司);ECLIPSEE100 型电子显微镜(南京江南
17、永新光学有限公司)。1.3 试验方法1.3.1菌株的鉴定参照 Hu 等22的方法,将6 株供试菌株在 MM 平板上于 25 下黑暗培养3d 后,刮取菌丝,使用 OMEGA真菌 DNA 提取试剂盒(百迈客生物科技有限公司)提取病原菌DNA。随后利用真菌通用正向引物 ITS-1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和反向引物 ITS-4(5-AACTTGCAATGTGG-3)对币斑病菌的ITS 基因进行扩增和测序,将测序结果进行拼接后,于 NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)上进行 BLAST 序列相似性搜索。利用 MEGA7.
18、0 软件和基于 1000 次重复的引导值构建系统发育树。标准菌株编号及其参考文献见附加材料表 S1。1.3.26PP 对菌株的抑制效率采用菌丝生长速率法23测定 6PP 对 6 株病菌的有效抑制中浓度(EC50)。菌株在 MM 培养基上预培养 3d 后,在菌落边缘取直径 6mm 的菌饼,分别接种到最终质量浓度为 0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25 和 0.275g/mL6PP 的 MM 平板上,接菌后将平板置于 25 黑暗条件下培养,以不含 6PP 的平板为对照。对照组菌落直径超过培养皿直径 2/3 时,采用十字交叉法测
19、量各处理的菌落直径,计算 6PP 对币斑病菌菌丝生长的抑制率,求出毒力回归方程。每个浓度重复 3 次,试验重复 2 次。1.3.36PP 对币斑病菌菌丝形态的影响在培养 2d的菌落(菌株 N8 和 N18)的边缘取菌饼转移到含有 0.075g/mL6PP 的 MM 培养基上,以不含6PP 的培养基为对照。在 25 下培养 3d 后,取适量菌丝在光学显微镜下观察菌丝形态。每个菌株设 3 个重复,试验重复 2 次。1.3.4免疫组织化学染色币斑病菌 N8 和N18 用于对活性氧(ROS)、过氧化氢(H2O2)进行染色,参照 Mojicak 等24方法。Tris-HCl 缓冲液(0.1mol/L,p
20、H=7.6)、质量浓度为 0.3%的氯化钴(CoCl2)按照体积比9:1 混合,将不同处理的菌丝浸泡在 3mL1mg/mL的 3,3-二氨基联苯胺(3,3-diaminobenzidine)染液中,显色时加入 510mL30%H2O2,染色 8h 后,将菌丝浸泡在无水乙醇中脱色 12h,光学显微镜下观察染色后的菌丝。1.3.56PP 对币斑病菌细胞膜通透性的影响参照 Duan 等25的方法,将币斑病菌 N8、N18 接种于 MM 上,25 培养 3d 后,打取 5 个直径 6mm的菌饼,接种于含有 100mLPDB 的 250mL 摇菌瓶中,于 25、175r/min 恒温摇床上摇培 36h后
21、,处理组添加 0.075g/mL 的 6PP,对照组添加等量的无菌水,继续培养 36h。于 5000r/min 下离心 10min 后收集菌丝,上清液备用。称取菌丝0.3g,悬浮于 20mL 的无菌水中,分别在 0、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160 和180min 时使用电导率仪测定溶液的电导率。之后将溶液煮沸 5min,并测定最终的电导率。每个菌株设 3 个重复,试验重复 2 次。按照公式(1)计算菌体的相对电导率。RC/%=R1R2100(1)式中:RC为相对电导率,%;R1为某时间的OO O图式 1 6-戊基-2H-吡喃-2-酮结构式Scheme 1 St
22、ructural formula of 6-pentyl-2H-pyran-2-one106农药学学报Vol.25电导率,S/cm;R2为再放入恒温水浴中加热5min,取出冷却至室温后再测定的电导率,S/cm。1.3.66PP 对币斑病菌 pH 值的影响按照 1.3.5 节方法培养草坪币斑病菌 N8 和 N18,打取 5 个直径 6mm 的菌饼,接种于含有 100mLPDB 的250mL 摇菌瓶中,于 25、175r/min 恒温摇床上摇培 36h 后,处理组添加 0.075g/mL 的6PP,对照组添加等量的无菌水,继续培养 36h。于 10000r/min 下离心 10min,收集上清液,
23、测定菌液 pH 值。每个菌株设 3 个重复,试验重复 2 次。1.3.7币斑病菌胞外多糖(EPS)含量测定参照文献方法测定26。取 1mL 上清液(同 1.3.5 节)至5mL 无菌离心管中,加入 3 倍体积的无水乙醇,于 10000r/min 下离心 60min,弃去无水乙醇,将沉淀物在 60 真空下干燥 60min,之后溶解于8mL 无菌水中,水解后取 2mL 溶液,加入 1mL5%苯酚溶液和 5mL 浓硫酸,涡旋 10s 后在 25放置 30min,在 490nm 处测量溶液的吸光值,并用葡萄糖标准曲线定量。以无菌水为对照。每处理设 3 个重复,试验重复 2 次。1.3.8丙二醛(MDA
24、)含量测定采用硫代巴比妥酸法27测定。按照 1.3.5 节方法处理并收集菌丝。将菌丝与 Tris-HCl 缓冲液(0.05mol/L,pH=7.5)按体积比1:5 研磨均质化,于 15000r/min 下冷冻离心 20min。以 2mL 上清液和 2mL0.5%硫代巴比妥酸为反应液,混匀后将试管放入沸水中煮10min,冷却后以 5000r/min 离心 10min。以0.5%硫代巴比妥酸溶液为对照组,分别于波长532、600 和 450nm 处测量吸光度值,计算 MDA含量。每处理设 3 个重复,试验重复 2 次。1.3.9币斑病菌对 6PP 的生理响应按照 1.3.5 节方法收集菌丝,称取
25、0.5g 菌丝于预冷的研钵中,加入 1mL 预冷 0.05mol/L 磷酸缓冲液(pH=7.8),于 12000r/min 下离心 10min,上清液用于过氧化物酶活性(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的测定。采用愈创木酚法28测定 POD 活性,以每分钟内 A470变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位(U)。采用氮蓝四唑(NBT)光还原法29测定 SOD 活性,以抑制 NBT 光化还原的 50%为 SOD 酶的一个活力单位(U)。1.3.106PP 对草坪离体叶片币斑病的防治作用采用离体叶片法测定 6PP 对草坪币斑病的预防和治疗作用30。预防作用测定:选取位于同一位置,大小相仿,
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