广西巴马小型猪NLRP6基因的克隆、生物信息学及组织表达分析.pdf
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1、-106-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期广西巴马小型猪NLRP6基因的克隆、生物信息学及组织表达分析江 山,张 帅,张 坤,许 迪,颜 港,邢天琦,王钰滨,王梦影,兰干球*,梁 晶*(广西大学动物科学技术学院,广西南宁 530004)摘 要:为探究 NLR Family Pyrin Domain Containing 6(NLRP6)在广西巴马小型猪的蛋白结构和组织表达水平,本实验以巴马小型猪为材料,通过克隆获取了NLRP6的 CDS 序列全长,并进行生物信息学和组织表达谱分析,同时采用 qRT-PCR 分析NLRP6基因在不同组织
2、的表达分布情况。结果显示,NLRP6基因的 CDS 序列全长为 2 640 bp,编码 879 个氨基酸。生物信息学分析表明,NLRP6 蛋白分子式预测为C4294H6958N1234O1272S37,等电点为 8.12,为亲水性碱性蛋白质。经氨基酸序列比对和物种进化树分析发现,广西巴马小型猪NLRP6基因与猪的遗传距离最近,其次是牛,与小鼠的遗传距离最远。qRT-PCR 结果表明,NLRP6基因在肾脏组织表达最高,同时在小肠部位具有很高的表达水平,但在心脏和肌肉组织中表达量极低。本研究结果为进一步研究猪NLRP6基因提供了理论参考。关键词:NLRP6基因;抗菌功能;肠道中图分类号:S828
3、文献标识码:A DOI 编号:10.19556/j.0258-7033.20221101-04我国是养殖大国,生猪养殖作为民族产业,有力地维持着国民经济的正常运转1。2020 年以来,国家大力推行畜禽饲料禁止添加抗生素的政策,我国的畜禽业迈入了绿色发展的高速通道2。肠道健康一直是生猪产业发展的焦点,通过人为营养调控的方法,能够改善肠道菌群结构和免疫功能,增强消化肠道维持微生态平衡的能力,以此提高肠道的消化吸收效率,有效地提高了生产性能和减少肠胃疾病的发生3。猪的胃肠道定居着多种肠道菌群,它们参与体内的代谢调控,对成长阶段的猪在健康方面发挥着举足轻重的作用4-5。NLRP6最早由 Grenier
4、 等6提出,NLRP6炎症小体广泛分布在肠道组织,可识别检测到多种来自肠道内部的危险信号,与众多下游信号通路关联,进而调控肠道的黏膜结构和微生态平衡7。寻找新型抗生素替代物是当今养殖生产刻不容缓的话题,抗菌肽以其独有的抗菌功能和耐药性引起了大家的广泛关注。目前关于NLRP6基因的研究主要集中在人类医学上,动物生产上的相关研究较少8-9。广西巴马小型猪作为广西地区的地方品种,毛色亮丽,肉质鲜美,具有广阔的市场前景。本研究通过对广西巴马小型猪NLRP6基因进行克隆,并进行生物信息学分析,对该基因在猪的不同组织表达情况进行分析,为进一步研究猪NLRP6基因的生物学功能提供理论基础。1 材料与方法1.
5、1 实验材料1.1.1 实验动物 在广西大学巴马小型猪繁育中心随机选取 20 头 6 月龄健康正常的广西巴马小型猪公猪,取其心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪、空肠、回肠、盲肠、直肠、结肠和十二指肠等 13 个组织备用。1.1.2 实验试剂 琼脂糖购自广西南宁市天地扬生物科技有限公司;Trizol 试剂、Taq Master Mix 酶、DL5000 DNA Marker 均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公收稿日期:2022-11-01;修回日期:2022-12-23资助项目:现代农业广西创新团队生猪首席专家(C334005 1510);广西创新驱动发展专项(桂科 AA17204029);广西科技
6、重大专项(桂科 AA17292002)作者简介:江山(1998-),男,湖北恩施人,硕士,研究方向为猪遗传育种,E-mail:*通讯作者:兰干球(1963-),男,广西来宾人,博士,教授,主要从事猪遗传育种研究,E-mail:;梁晶(1989-),男,安徽淮北人,博士,助理教授,主要从事猪遗传育种研究,E-mail:-107-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 司;PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa,Code No.RR047A)购自 TaKaRa 公司。1.2 实验方
7、法1.2.1 引物设计及合成 根据 GenBank 网站中猪NLRP6基因预测序列(登录号:XM_021082529.1)利用 Oligo7.0软件设计克隆和定量引物,同时设计GAPDH(登录号:NM_001206359.1)的定量引物(表 1),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.2.2 RNA 提取及 cDNA 合成 将广西巴马小型猪的13 个组织用 Trizol 法提取 RNA,操作严格参照试剂说明书的方法进行。并用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA,分析 RNA 的完整性和降解程度,-80保存。使 用 PrimeScript RT reagent Kit With gDNA
8、Eraser 试剂盒逆转录合成 cDNA,-80保存。1.2.3 NLRP6基因克隆 以广西巴马小型猪的 13 个组织 cDNA 为混池进行 PCR 扩增。反应体系 10 L:2Rapid Taq Master Mix 5 L,上下游引物(10 mol/L)各 0.4 L,ddH2O 3.2 L,cDNA 模板 1 L。反应程序:95预变性 5 min;95变性 15 s,59.7退火 15 s,72延伸 10 s,共 40 个循环;72终延伸 5 min。将带有目的基因的 PCR 扩增液送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。1.2.4 生物信息学分析 测得的序列利用 SeqMan 进行拼
9、接;采用 DNAStar10.0 软件中的 MegAlign 比对广西巴马小型猪NLRP6基因与其他物种的同源性并构建进化树;运用 ProtParam、ProtScale 和 SignalP 5.0 进行理化性质、亲疏水性和蛋白信号肽分析,通过 TMHMM server 2.0、Prabi SOPMA 和 SWISS-MODEL 在线软件预测广西巴马小型猪 NLRP6 蛋白跨膜结构、二级结构及三级结构。采用 STRING 10.0 和 SMART 在线软件分别进行 NLRP6 编码蛋白互作预测和结构分析。1.2.5 NLRP6基因组织表达分析 以广西巴马小型猪 13个组织反转录的 cDNA 为
10、模板,通过实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)检测NLRP6基因的表达情况,相对表达以GAPDH作为内参基因。qRT-PCR 反应体系 10 L:上、下 游 引 物 各(10 mol/L)0.4 L,2Taq Master Mix 5L,ddH2O 3.2 L,cDNA 1L。反 应 条 件 为:95,30 s;95,5 s;60,30 s;38 个循环。1.2.6 数据分析 本实验采用相对定量法,运用 2-CT的方法计算基因在各组织中的相对表达量,并使用SAS 9.2软件进行单因素方差分析,P0.05 为差异显著。运用Graphpad Prism 8.0 进行可视化。2 结 果2.1 NL
11、RP6基因克隆 PCR 产物通过 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,结果在 2 711 bp 处有一条明亮的条带(图 1),与预期结果一致,说明在广西巴马小型猪上成功克隆出了NLRP6基因。用 SeqMan 软件对测序序列进行剪切比对,获得了NLRP6的 CDS 全长 2 640 bp,编码 879个氨基酸。2.2 广西巴马小型猪NLRP6基因生物信息学分析2.2.1 同源性分析及进化树构建 使用 DNAStar 软件将测序结果与 GenBank 上已有的 7 条不同的NLRP6基因编码的氨基酸序列进行同源性比对(图 2),并据此构建系统发育树(图 3)。结果表明广西巴马小型猪与猪的参考序列一致性最
12、近,其次是牛,与小鼠的遗传距离最远。广西巴马小型猪NLRP6基因编码的氨基酸序列与 GenBank 上猪(Sus scrofa,登录M:DL5000 DNA Marker;1:NLRP6。图 1 广西巴马小型猪NLRP6基因 PCR 扩增结果表 1 引物序列信息及合成用途引物序列(53)长度,bp最适温度,用途NLRP6F:GTAGAGCGCTACCCAGCTTT;R:AATGGAGCCCTCCCAGGTT271159.7普通 PCRq-NLRP6F:CTGCAAACCCTCAGGCTAAC;R:TCGTGTGTGATGACCAGTCC10160.0实时荧光定量 PCRq-GAPDHF:CAG
13、GTTGTGTCCTCTGACTT;R:ACCCTGTTGCTGTAGCCAA13460.0实时荧光定量 PCR1MNLRP65000 bp3000 bp2000 bp1500 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp-108-遗传育种Genetics and Breeding 2023 年 第 59 卷 第 08 期号:XM_021082529.1)、狗(Canis lupus,登录号:XM_038423977.1)、大鼠(Rattus norvegicus,登录号:NM_134375.5)、小鼠(Mus musculus,登录号:NM_133946.2)、人(Ho
14、mo sapiens,登录号:NM_001276700.2)、黑猩猩(Pan troglodytes,登录号:XM_016919943.2)、猕 猴(Macaca mulatta,登 录 号:NM_001114114.1)、牛(Bos taurus,登录号:XM_002683733.6)的一致性依次是 99.8%、75.4%、71.7%、70.2%、77.7%、77.9%、77.4%和 79.8%。2.2.2 NLRP6 蛋 白 理 化 性 质 分 析 广 西 巴 马 小 型 猪NLRP6基因编码蛋白分子式为 C4294H6958N1234O1272S37,原子总数 13 796,理论等电点(
15、PI)为 8.12,表明该蛋白为碱性蛋白,不稳定系数为 53.23,脂溶指数为92.95,亲水性平均系数(GRAVY)为-0.251。氨基酸组成分析发现(表 2),天冬酰胺(Asn)和色氨酸(Trp)含量最低为 0.5%,亮氨酸(Leu)含量最高(15.5%);不含吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸,带负电荷的氨基酸残基(Asp+Glu)共 111 个,占比为 12.6%;而带正电荷的氨基酸残基(Arg+Lys)共 116 个,占比为 13.2%。如果所有的半胱氨酸(Cys)残基都形成胱氨酸,NLRP6蛋白水溶液在 280 nm 处的消光系数为 50 570;假设所有的 Cys 残基都被还原,其水溶液在
16、280 nm 处的消光系数则为 48 820。该多肽链总平均亲水性为-0.578,属于亲水性蛋白质(图 4)。图 4 广西巴马小型猪 NLRP6 蛋白质亲/疏水性分析表 2 广西巴马小型猪 NLRP6 氨基酸种类及组成 图 3 广西巴马小型猪NLRP6基因序列的系统进化树图 2 8 个物种的NLRP6基因编码的氨基酸序列同源性比对结果图人Homo sapiens NM_001276700.2 黑猩猩 Pan troglodytes XM_016919943.2 猕猴 Macaca mulatta NM_001114114.1 大鼠 Rattus norvegicus NM_134375.5 小
17、鼠 Mus musculus NM_133946.2 广西巴马小型猪 Guangxi bama mini pig 猪 Sus scrofa XM_021082529.1牛 Bos taurus XM_002683733.6 狗 Canis lupus XM_038423977.1广西巴马小型猪 Guangxi bama mini pig 猪 Sus scrofa XM_021082529.1 狗 Canis lupus XM_038423977.1大鼠 Rattus norvegicus NM_134375.5 小鼠 Mus musculus NM_133946.2 人Homo sapiens
18、 NM_001276700.2 黑猩猩 Pan troglodytes XM_016919943.2 猕猴 Macaca mulatta NM_001114114.1 牛 Bos taurus XM_002683733.6氨基酸数量,个占比,%氨基酸数量,个占比,%Ala(A)869.8Lys(K)424.8Arg(R)748.4Met(M)80.9Asn(N)40.5Phe(F)303.4Asp(D)354.0Pro(P)515.8Cys(C)293.3Ser(S)586.6Gln(Q)536.0Thr(T)374.2Glu(E)768.6Trp(W)40.5Gly(G)596.7Tyr(Y
19、)182.0His(H)151.7Val(V)495.6Ile(I)151.7Pyl(O)00.0Leu(L)13615.5Sec(U)00.0相似性差异度123456789199.875.471.770.277.777.977.479.8120.275.671.970.377.978.277.680.12329.829.569.768.274.875.573.674.83435.535.138.784.873.473.872.970.24537.937.741.317.071.872.371.667.65626.626.230.732.935.398.594.775.66726.225.92
20、9.732.334.61.594.675.97827.026.732.633.735.65.55.675.38923.523.230.738.042.429.629.129.9912345678927.525 20 15 10 5 0Hphob./Kyte&Doolittle分值位置3210-1-2-3-40 100 200 300 400 500 600 700 800-109-2023 年 第 59 卷 第 08 期 Science and Technology科学技术 2.2.3 NLRP6 蛋白跨膜结构、信号肽预测 分析广西巴马小型猪 NLRP6 蛋白跨膜结构(图 5)和信号肽(图 6
21、),结果表明该蛋白不含跨膜结构和信号肽。2.2.4 NLRP6二级结构和三级结构预测 Prabi SOPMA软 件 分 析 该 蛋 白 含 有-螺 旋(54.04%)、-折 叠(8.08%)、-转角(4.55%)和无规则卷曲(33.33%)等 二 级 结 构(图 7)。用 SWISS-MODEL 软 件 预 测NLRP6蛋白三级结构,其结构以无规则卷曲为主(图8)。2.2.5 NLRP6 编码蛋白互作蛋白和结构分析 STRING 预测分析与NLRP6基因编码蛋白的互作蛋白(图 9),主要有 CNPY3、DDX21、DHX15、ASC、MEPV、IL-18、NLRC4、CASP1、NLRC5、E
22、NSSSCP00000026110。SMART 预测发现,第 889 个氨基酸有一个热蛋白结 构 域,第 154165、第 304320、第 340351、第593615 和第 219(重复没有显示)共 5 个低复杂区,第 714741、第 742769 和 798825 共有 3 个富亮氨酸的重复序列(图 10)。2.3 广西巴马小型猪NLRP6的组织表达分析 选取广图 8 广西巴马小型猪 NLRP6 三级结构预测图 7 广西巴马小型猪 NLRP6 二级结构预测图 6 广西巴马小型猪 NLRP6 蛋白信号肽预测图 5 广西巴马小型猪 NLRP6 蛋白跨膜结构预测MEPLAAAARELLLVA
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