川芎嗪对阿尔茨海默病小鼠神经的保护作用.pdf
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1、药物研究 中国现代医生 2023 年 8 月第 61 卷第 24 期 CHINA MODERN DOCTOR Vol.61 No.24 August 2023 96 川芎嗪对阿尔茨海默病小鼠神经的保护作用 肖寒露1,何超芹1,周百桂2,章娟娟1 1.浙江金华广福肿瘤医院药剂科,浙江金华 321000;2.浙江金华广福肿瘤医院神经内科,浙江金华 321000 摘要 目的 探讨川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)小鼠海马神经组织的保护作用。方法 以 C57BL/6 小鼠作为对照组,APP/PS1 双转基因小鼠作为模型组
2、、TMP 低、中、高剂量组灌胃 20、40、60mg/kg TMP,1 次/d,连续 30d。Morris 水迷宫实验检测小鼠学习记忆和空间探索能力,酶联免疫吸附法检测小鼠海马神经组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性、丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量、肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)、白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-10、-淀粉样蛋白(-amyloid protein,A)1-40、A1-42、
3、-淀粉样前体蛋白(-amyloid precursor protein,-APP)含量。结果 与对照组比较,模型组内平均逃避潜伏期延长,平台停留时间、跨平台次数、SOD 活性、GSH-Px 活性降低(P0.05),MDA 含量、TNF-、IL-1、IL-10、A1-40、A1-42、-APP 含量上升(P0.05)。与模型组比较,TMP 低、中、高剂量组小鼠平均逃避潜伏期缩短,平台停留时间、跨平台次数、SOD 活性、GSH-Px 活性上升(P0.05),MDA含量、TNF-、IL-1、IL-10、A1-40、A1-42、-APP 含量降低(P0.05)。结论 TMP 能改善 AD 小鼠学习记忆
4、能力,减轻海马神经组织氧化应激和炎症反应,减少 A 含量。关键词 川芎嗪;阿尔茨海默病;氧化应激;炎症反应;A 水平 中图分类号 R749.16 文献标识码 A DOI 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.24.022 Tetramethylpyrazine protects neural in mouse model of Alzheimers disease XIAO Hanlu1,HE Chaoqin1,ZHOU Baigui2,ZHANG Juanjuan1 1.Department of Pharmacy,Zhejiang Jinhua Guangfu Tum
5、or Hospital,Jinhua 321000,Zhejiang,China;2.Department of Neurology,Zhejiang Jinhua Guangfu Tumor Hospital,Jinhua 321000,Zhejiang,China Abstract Objective To explore the protective effect of tetramethylpyrazine(TMP)on hippocampal neural tissue in Alzheimers disease(AD)mice.Methods The C57BL/6 mice we
6、re used as the control group,the APP/PS1 double transgenic mice were used as the model group,and the TMP low,medium and high dose groups were given intragastric administration of 20,40,and 60mg/kg of TMP,once a day for 30 consecutive days.Morris water maze test was used to detect the learning and me
7、mory and space exploration ability of mice.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect superoxide dismutase(SOD)activity,glutathione peroxidase(GSH-Px)activity,malonaldehyde(MDA)content,tumor necrosis factor-(TNF-),interleukin(IL-)-1,IL-10,-amyloid protein(A)1-40,A1-42,-amyloid precursor pr
8、otein(-APP)content in mouse hippocampal nerve tissue.Results Compared with the control group,the escape latency of the mice in the model group was prolonged,and the platform residence time,the times of cross-platforms,SOD activity,and GSH-Px activity were reduced(P0.05),MDA content,TNF-,IL-1,IL-10,A
9、1-40,A1-42,-APP content were increased(P0.05).Compared with the model group,the escape latency of mice in the low,medium,and high dose groups of TMP was shortened,and the platform residence time,cross-platform times,SOD activity,and GSH-Px activity were increased(P0.05),MDA content,TNF-,IL-1,IL-10,A
10、1-40,A1-42,-APP content increased(P0.05).Conclusion TMP can improve the learning and memory ability of AD mice,reduce the oxidative stress and inflammation of hippocampal nerve tissue,and reduce the content of A.Key words Tetramethylpyrazine;Alzheimers disease;Oxidative stress;Inflammatory response;
11、A level 阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)是一种起病隐匿的中枢神经系统疾病,临床症状主要为认知障碍、执行能力障碍、失语等1。AD 的主要病理特征包括细胞外间隙-淀粉样蛋白(-amyloid protein,A)沉积形成的老年斑、异常磷酸化的 Tau蛋白聚集形成的神经原纤维缠结、神经炎症、神经元突触丢失和线粒体损伤2。因此 AD 可通过改善认知功能、清除氧化自由基、提高活性氧表达、抑制炎症因子分泌、减少 A 形成及沉积等多种途径防治AD 的发展3。淀粉样蛋白毒性学说对 AD 的发病、通信作者:肖寒露,电子信箱: 中国现代医生 2023 年 8 月第 61 卷第 2
12、4 期 药物研究 CHINA MODERN DOCTOR Vol.61 No.24 August 2023 97发展起到重要作用,也是 AD 发病的中心环节4。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是一种钙拮抗剂,从中药材川芎中提取的主要活性物质之一,具有抗氧化、抗炎、降血栓、抗凋亡、抗纤维化和抗肿瘤等作用,且在神经退行性疾病 AD、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化和多发性硬化及心脑血管疾病中起重要作用5。已有研究证明,TMP 对 AD具有良好的治疗作用,能够减轻 AD 小鼠神经元凋亡、氧化损伤和炎症损伤,减少 AD 功能障碍6。但TMP 对 APP/PS1 双转基因小鼠的
13、研究机制尚不清楚。本研究以 APP/PS1 双转基因小鼠为研究对象,探讨 TMP 对 AD 模型小鼠海马神经组织保护和 A水平作用及其相关机制,旨在为 AD 的研究提供实验依据。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂 TMP(浓度98%,批准文号:国药准字 H20057041,生产单位:江苏永健医药,规格:2ml40mg);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)检测试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司);肿瘤坏死因子-(tumor
14、necrosis factor-,TNF-)检测试剂盒、白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-10检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);A1-40、A1-42、-淀粉样前体蛋白(beta-amyloid precursor protein,-APP)检测试剂盒(上海一研生物科技有限公司);二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)试剂盒、显色剂(北京索莱宝科技有限公司)。1.1.2 实验动物 5月龄SPF级APP/PS1双转基因小鼠 40 只,实验动物合格证号:SCXK(京)2014-0004。同月龄 C57BL/6 小鼠 10 只(北京华阜康生物科技股份有限公
15、司)。实验动物饲养于本实验室,自由饮水、进食,室温 2326,湿度 50%70%。所有小鼠适应 1 周后进行实验,本研究经浙江金华广福肿瘤医院伦理委员会批准(伦理审批号:20-085)。1.2 方法 1.2.1 小鼠的分组及处理 C57BL/6 小鼠作为对照组,APP/PS1 双转基因鼠分为模型组、TMP 低、中和高剂量组,分别灌胃 20、40、60mg/kg TMP,对照组和模型组灌胃 0.2ml 生理盐水,1 次/d,连续30d。1.2.2 Morris 水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力 给药 30d 后,开始进行 Morris 水迷宫实验。实验 5d 完成,从第 1 天开始训练小鼠,训练时
16、将小鼠头部面向池壁放入水内,记录小鼠找到平台的时间即为逃避潜伏期,90s 内小鼠未找到平台,可直接将小鼠引至平台。第 5 天定位实验结束后,将平台撤出,在标记的特定位置将小鼠放入水中,观察小鼠 90s 内在原平台停留时间、跨平台次数。1.2.3 ELISA 检测海马神经组织 SOD 活性、GSH-Px活性、MDA、TNF-、IL-1、IL-10、A1-40、A1-42、-APP 含量 将海马神经组织剪碎,加入磷酸盐缓冲液,4 12000 转/min 离心 5min 收集上清液,按照酶联免疫吸附实验检测试剂盒说明书步骤进行,采用酶标仪检测对应波长处的光密度值,并依据相应的标准曲线计算 MDA 含
17、量、TNF-、IL-1、IL-10、A1-40、A1-42、-APP。1.3 统计学方法 采用 SPSS 20.0 统计学软件对数据进行处理及分析,计量资料均符合正态分布并以均数标准差(xs)表示,两两比较采用 t 检验。计数资料以例数(百分率)n(%)表示,组间比较采用 2检验,P0.05 为差异有统计学意义。2 结果 2.1 TMP 对 AD 小鼠逃避潜伏期的影响 与对照组比较,模型组平均逃避潜伏期延长(P0.05);与模型组比较,TMP 低、中和高剂量组平均逃避潜伏期均缩短(P0.05),见图 1。2.2 TMP 对 AD 小鼠空间探索能力的影响 与对照组比较,模型组平台停留时间、跨平台
18、次数降低(P0.05);与模型组比较,TMP 低、中和高剂量组平台停留时间、跨平台次数均增加(P0.05),见图 2。2.3 TMP 对 AD 小鼠海马神经组织氧化应激的影响 与对照组比较,模型组海马神经组织中 SOD 活性、GSH-Px 活性显著降低(P0.05),MDA 含量增加(P0.05);与模型组比较,TMP 低、中和高剂量组海马神经组织中 SOD 活性、GSH-Px 活性均显著增加(P0.05),MDA 含量均降低(P0.05),见图 3。2.4 TMP 对 AD 小鼠海马神经组织炎症反应的影响 与对照组比较,模型组海马神经组织 TNF-、IL-1、IL-10 含量增加(P0.05
19、);与模型组比较,TMP 低、中和高剂量组海马神经组织 TNF-、IL-1、IL-10 含量均降低(P0.05),见图 4。药物研究 中国现代医生 2023 年 8 月第 61 卷第 24 期 CHINA MODERN DOCTOR Vol.61 No.24 August 2023 98 2.5 TMP 对 AD 小鼠海马神经组织中 A 含量的影响 与对照组比较,模型组海马神经组织 A1-40、A1-42、-APP 含量增加(P0.05);与模型组比较,TMP 低、中和高剂量组海马神经组织 A1-40、A1-42、-APP 含量均降低(P0.05),见图 5。图 1 各组小鼠逃避潜伏期的比较
20、注:与对照组比较,*P0.05;与模型组比较,#P0.05 图 2 各组小鼠空间探索能力比较 注:与对照组比较,*P0.05;与模型组比较,#P0.05 图 3 各组小鼠 SOD 活性、GSH-Px 活性、MDA 含量水平比较 注:与对照组比较,*P0.05;与模型组比较,#P0.05 中国现代医生 2023 年 8 月第 61 卷第 24 期 药物研究 CHINA MODERN DOCTOR Vol.61 No.24 August 2023 99 图 4 各组小鼠 TNF-、IL-1、IL-10 水平比较 注:与对照组比较,*P0.05;与模型组比较,#P0.05 图 5 各组小鼠 A1-4
21、0、A1-42、-APP 含量水平比较 注:与对照组比较,*P0.05;与模型组比较,#P0.05 3 讨论 AD 是一种广泛、进行性、不可逆及破坏性的神经退行性疾病,是导致痴呆的主要原因,血管疾病、吸烟、高血压、糖尿病、高胰岛素血症和神经炎症被证实会增加患临床 AD 的风险1。AD 的病因尚不明确,主要有氧化应激学说、A 毒性学说、神经凋亡学说及基因突变学说,其中 A 毒性学说是主流学说7。Morris 水迷宫实验广泛用于学习记忆、老年痴呆、神经生物学、动物心理学等多个领域,可用来研究动物的空间记忆和学习能力,在验证神经认知障碍的啮齿动物模型中发挥重要作用8。氧化应激是神经退行性疾病包括 A
22、D 的主要病理过程,AD 患者氧化应激相关的活性氧过量产生导致膜损伤、细胞骨架改变和细胞死亡,对大脑中的脂质和蛋白质造成不利影响,影响认知和大脑功能9。MDA 是 ROS造成生物膜脂质氧化过程中产生的,是氧化应激生物标志物,能够反映机体脂质过氧化强度和速率,可以间接反应氧化损伤程度;SOD、GSH-Px 是清除自由基抗氧化物的关键酶,能够保护机体氧化自由基免受损伤,因此 SOD 和 GSH-Px 活性可反映清除自由基能力,作为检测氧化应激的生物学指标10。炎症反应是人体的一种防御机制,是抵抗损伤和感染的重要生理和病理过程,在各种神经系统疾病包括 AD 中炎症反应起重要作用。在 AD 人类和动物
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