超高效液相色谱-串联质谱法同时测定人血清中4种硝基呋喃类代谢物.pdf
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1、卫生检验与实验研究566JiangsuJPrevMedVol.34,No.5江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期超高效液相色谱-串联质谱法同时测定人血清中4种硝基呋喃类代谢物曹杰,王强”,孔凡”,宋寅生,张春玲,徐虹1.镇江市疾病预防控制中心,江苏镇江2 12 0 0 4;2.江苏大学医学院摘要:目的建立超高效液相色谱-串联质谱法,同时测定人血清中3-氨基-2-嗯唑烷基酮(AOZ)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-嗯唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、1-氨基-2-内酰脲(AHD)4种硝基呋喃类代谢物浓度。方法在酸性条件下,4种硝基呋喃类代谢物水解、衍生,经乙酸乙酯提取净化,在色谱
2、柱WatersBEHC18(2.1mm10 0 mm,1.7 m)上分离,以流动相甲醇-2mmol/L乙酸铵体系进行梯度洗脱。采用电喷雾离子源正离子扫描和多反应监测模式检测,定量方法为同位素内标法。结果AOZ在质量浓度范围2.8 8 4ng/mL、A M O Z在质量浓度范围2.4 7 2 ng/mL、A H D 在质量浓度范围5.4 16 3ng/mL、SEM在质量浓度范围2.2 6 6 ng/mL内线性关系良好,相关系数r均 0.998,检出限分别为0.5、0.5、2.7、1.1ng/mL;低、中、高质量浓度的回收率为7 3.8%10 6.7%,相对标准偏差(RSD)为2.7%13.1%,
3、精密度良好。血清样品短期稳定性良好。结论该方法灵敏、准确、稳定,可用于人血清中4种硝基呋喃代谢物AOZ、A M O Z、A H D、SEM 的同时检测。关键词:超高效液相色谱;质谱法;硝基呋喃类代谢物中图分类号:R113文献标识码:B文章编号:10 0 6-90 7 0(2 0 2 3)0 5-0 56 6-0 4硝基呋喃类药物是人工合成的广谱抗生素,主要含有呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因等。因其价格低廉、抗菌消炎疗效较好被广泛地应用于临床治疗,也常用于预防与治疗家畜和水产动物的细菌性疾病。但因其致畸、致癌、致突变等严重副作用,目前很多国家已明确限制应用,并规定动物组织内禁止检出硝基喃
4、类残留。硝基呋喃类药物呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮的代谢物分别为3-氨基-2-嗯唑烷基酮(AOZ)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-嗯唑烷基酮(A M O Z)、氨基脲(SEM)、1-氨基-2-内酰脲(AHD)。该类代谢物残留的检测方法有多种 ,如高效液相色谱法2 、超高效液相色谱法3、液相色谱-串联质谱法4-6 、超高效液相色谱-串联质谱法7 和免疫层析技术8 等。大多检测的是兽药、动物源性食品或者水产品中硝基呋喃类代谢物残留4-6 ,人生物样本中的报道较少。超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)9-1 因其高效、灵敏、准确等的优势被广泛应用。本实验建立同时测定人血清中4种
5、硝基呋喃类代谢物的超高效液相色谱-串联质谱法。1材料与方法1.1仪器与试剂AB SCIEXQTRAP?4500质谱仪(A BSCIEX),A g i l e n t 12 90 超高效液相色谱仪(AgilentTechnologies),Vo r t e x-K y l i n-Be l l 5型漩涡振荡器(Sci-entific Industries),N-EVA P111氮吹仪(OrganomationAssociatesJnc.)等。标准品:3-氨基-2-嗯唑烷基酮(10 m g,纯度99.1%);5-甲基吗啉-3-氨基-2-嗯唑烷基酮(10 mg,纯度99.5%)、氨基脲(10 0 m
6、g,纯度99.0%)、1-氨基-2-内酰脲(10 0 mg,纯度99.0%)。同位素内标:AOZ-D4(10 mg,纯度99.5%)、AMOZ-D,(10mg,纯度99.1%),北京曼哈顿生物技术公司;SCA-HCl(10 mg,纯度99.1%)、AHD-13C,(10 mg,纯度99.9%)。甲醇、乙腈、乙酸乙酯(色谱纯,美国MERK公司),乙酸铵、二甲亚矾、氨水(优级纯,国药集团化学试剂有限公司),正已烷(色谱纯,TEDIA公司),实验用水为超纯水。衍生化试剂(0.0 5mol/L):称取一定量的邻硝基苯甲醛溶于二甲亚矾中,冷藏保存。1.2标准溶液配制精密称取AOZ、A M O Z、SEM
7、、AHD标准品,甲醇溶解,配制成质量浓度分别为140、120、110、136 g/mL的标准储备溶液,于-2 0 保存备用。精密称取AMOZ-Ds、A O Z-D 4、SCA-H CL、A H D-13C,同位素内标溶液,甲醇溶解,配制成质量浓度分别为117、131、12 3、95g/mL的同位素内标储备液,于-20保存。混合标准使用溶液:准确吸取适量D01:10.13668/j.issn.1006-9070.2023.05.015基金项目:江苏大学大学生创新训练项目(2 0 2 310 2 992 7 7 H)作者简介:曹杰(198 3一),女,山东菏泽人,副主任医师,主要从事食品卫生与环境
8、卫生检验工作通信作者:徐虹,主任技师,E-mail:js z jx h s in a.c o m567JiangsuJPrevMeVol.34,No.5江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期AOZ、A M O Z、SEM、A H D 储备溶液,用乙定量稀释,制成质量浓度为140、12 0、110、2 7 2 ng/mL的混合标准使用液,于4储存。同位素混合内标溶液:准确吸取适量AMOZ-Ds、A O Z-D 4、SCA-H CL、A H D-13C,储备溶液,用乙腈定量稀释,制备成质量浓度分别为117、131、12 3、19 0 n g/m L 的混合内标溶液,储存于4冰箱。1.3仪
9、器工作条件1.3.1色谱条件色谱柱为WatersBEHCis柱:2.1mmx100mm,1.7m,柱温:40。流动相:水相A为2 mmol/L乙酸铵溶液,有机相B为甲醇,线性梯度洗脱程序:0 1.0 min时,B为10%;1.0 3.0 min时,B由10%升至9 0%,保持1.0 min;4.04.5min时,B由9 0%降至10%,保持2.5min。流速0.3mL/min,进样量为10L。1.3.2质谱条件电喷雾离子源正离子扫描,多反应监测模式;电喷雾电压为550 0 V;离子源温度为550;碰撞气选择Medium;气帘气压力为30 psi,雾化气压力为50 psi,辅助加热气压力为6 0
10、 psi。见表1。表1目标化合物的质谱参数离子对质荷比去簇电压碰撞能量化合物(m/z)(DP)/V(CE)/eVAOZ236.1/134.0*7017236.1/104.07026AMOZ335.0/291.1*8016335.0/262.18022SEM209.1/192.060143 209.1/166.0*6013AHD249.1/134.9*7030249.1/104.87038AOZ-D4240.1/134.0*7017AMOZ-Ds340.2/296.1*7016SCA-HCL212.1/168.1*6013AHD-13C3252.2/133.9*7016注:*为定量离子对。1.4
11、检测方法1.4.1血清样品前处理取-2 0 保存的血清样品,室温自然解冻后,吸取1.0 mL于50 mL塑料离心管中,加入同位素混合内标溶液10 0 L,轻轻振荡混匀30 s,依次加人5.0 mL0.2mol/L盐酸溶液和2 0 0 L0.05mol/L衍生化试剂12 ,涡旋振荡混匀30 s,置摇床振荡30min,于37 电热鼓风干燥箱中衍生化16 h。衍生化完毕后冷却至室温,加入4 6 mL1mol/L的磷酸氢二钠溶液调节pH值至7.0 7.5再加入5mL乙酸乙酯12 ,振荡混匀6 0 s,10000r/min低温离心5min(离心半径119 mm),取出上层乙酸乙酯,备用;再加乙酸乙酯5m
12、L重复提取1次,将2 次乙酸乙酯层合并,氮吹近干。加入1mL乙腈水(1:9)复溶,涡旋30 s,加人正已烷2 mL,轻轻涡旋30 s,10 0 0 0 r/m in 低温离心5min(离心半径119 mm),取下层溶液经0.2 2 m有机滤膜过滤,上机进行仪器分析。1.4.2扫描化合物离子对分别吸取硝基呋喃代谢物储备液(AOZ、A M O Z、SEM、A H D 标准品及同位素内标)各10 0 L于50 mL塑料离心管中,经衍生化、提取、净化、氮吹近干(方法同前处理),最后加人1mL甲醇复溶,涡旋振荡30 s,用0.2 2 m有机滤膜过滤,上机扫描各化合物的母离子和子离子,优化质谱参数。1.4
13、.3制备空白血清基质标准工作曲线溶液准确吸取2 0、50、10 0、2 0 0、40 0、6 0 0 L混标使用液,各加人1mL空白血清,制成血清样品浓度系列,质量浓度AOZ的分别为2.8、7.0、14、2 8、56、8 4ng/mL,A M O Z分别为2.4、6.0、12、2 4、48、7 2 ng/mL,SEM分别为2.2、5.5、11、2 2、44、6 6 n g/mL,A H D 分别为5.4、13.6、27.2、54.4、10 9、16 3n g/m L,按照1.4.1操作,制成空白血清基质标准工作曲线系列溶液1.4.4丝结果计算根据仪器自动绘制的空白血清基质标准工作曲线,算出血清
14、样品中4种硝基呋喃类代谢物的含量(ng/mL)。2结果2.1标准物质的色谱图4种硝基呋喃代谢物及其同位素内标的多反应监测色谱图见图1和图2。图1为4种同位素内标在空白人血清中的色谱图(AMOZ-Ds、AHD-13C3、A O Z-D.和SCA-HCL质量浓度分别为11.7、19.0、13.1、12.3n g/mL)。图2 为空白血清基质标准工作曲线溶液某浓度点的色谱图,AMOZ、A H D、A O Z、SEM质量浓度分别为48、10 9、56、44ng/mL。2.2标准曲线和检出限艮在上述色谱质谱条件下,测定空白血清基质标准工作溶液,结果AOZ在质量浓度范围2.8 8 4ng/mL、A M O
15、 Z在质量浓度范围2.472ng/mL、A H D 在质量浓度范围5.4 16 3ng/mL、SEM在质量浓度范围2.2 6 6 ng/mL内线性关系良好,相关系数均 0.9 9 8,检出限分别为0.5、0.5、2.7、1.1 n g/m L。见表2。2.3回回收试验和准确度使用空白血清样品,精密配制含4种硝基呋喃类代谢物的低、中、高3种浓度血清样品(质量控制样品)各5份,按照前处理方法操作后,重复测定6 次。4种硝基喃类代谢物低、中、高质量浓度的回收率为7 3.8 10 6.7%,相对标准偏差(RSD)为2.7%13.1%,精密度良好,见表3。568JiangsuJPrevMedVol.34
16、,No.5江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期3.691.00 x105AMOZ-D55.00104000.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5保留时间(min)3.462.0 x104AHD-13C31.0 x10400.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5保留时间(min)3.535.01044.01842.89AOZ-D42.0 x1040400.51.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5保留时间(m
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