γ-聚谷氨酸的制备及其酪氨酸酶抑制活性研究.pdf
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1、天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1766-1774-聚谷氨酸的制备及其酪氨酸酶抑制活性研究李想2,吴金芳12,韩冠英,2*1锦州医科大学药学院,锦州12 10 0 0;山东丰金生物医药有限公司,烟台2 6 40 0 0摘要:-聚谷氨酸(-polyglutamic acid,-PGA)是一种阴离子自然聚合物,其被广泛应用于诸多领域。为探究不同分子量-PGA作为潜在的化妆品美白剂应用的可能性,本文以枯草芽孢杆菌作为产生菌,通过微生物发酵法制备了-PGA,并结合化学降解手段制备了5 组不同分子量的-PGA。以胞内胞外酪氨酸酶活性抑制率为指标,对 5 组不同分子量-PGA抑
2、制酪氨酸酶活性进行了初步研究。结果显示,在90,pH3.0的降解条件下,降解得到了分子量依次为2 1、117、2 8 2、432 和50 1kDa五组分子量的-PGA。采用酶标仪酶动力学功能测定发现5组分子量的-PGA作用于胞内胞外均具有抑制酪氨酸酶活性能力,且胞外酪氨酸酶活性抑制率随分子量的增加而增大,初步验证了不同分子量-PGA的酪氨酸酶抑制活性。关键词:-聚谷氨酸;发酵;酪氨酸酶活性中图分类号:R915D0I:10.16333/j.1001-6880.2023.10.013Preparation of y-polyglutamic acid and its tyrosinase inhi
3、bition activity文献标识码:ALI Xiang2,WU Jin-fang*2,HAN Guan-ying文章编号:10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)10-17 6 6-0 9o.1,2*School of Pharmaceutical Sciences,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China;2 Shandong Fengjin Biomedicine Limited Company,Yantai 264000,ChinaAbstract:-Polyglutamic acid(y-PGA)is an anioni
4、c natural polymer,which is widely used in many fields.In order to ex-plore the possibility of using y-PGA with different molecular weight as a potential cosmetic whitening agent,-PGA was pre-pared by microbial fermentation with Bacillus subtilis as producing strain,and five groups of y-PGA with diff
5、erent molecularweight were prepared by chemical degradation.Taking the inhibition rate of intracellular and extracellular tyrosinase activityas an index,the tyrosinase inhibitory activity of five groups of-PGA with diferent molecular weight was studied.The resultsshowed that y-PGA with molecular wei
6、ght of 21,117,282,432 and 501 kDa was obtained at 90 C a n d p H 3.0.T h e d e t e r-mination of enzyme kinetic function by enzyme labeling instrument showed that all the five groups of molecular weight y-PGAcould inhibit tyrosinase activity,and the inhibition rate of extracellular tyrosinase activi
7、ty increased with the increase of molecular weight,which preliminarily verified the tyrosinase inhibition activity of y-PGA with different molecular weight.Key words:-polyglutamic acid;fermentation;tyrosinase activity均聚氨基酸一类的高分子聚合物具有生物学功能广泛、生物相容性和分子量分布分散等特性。目前通过微生物得到的均聚氨基酸主要包括三种:聚谷氨酸(聚-谷氨酸,poly-glut
8、amic acid,-PGA)、8-聚赖氨酸(-poly lysine,8-PL)和藻青素(cyano-phycin))。-PG A 作为其中的一种,同样具有其优良的生物学特性。从1913年起,研究人员相继从纳收稿日期:2 0 2 3-0 3-0 2基金项目:辽宁省教育厅2 0 2 2 年度基本科研项目面上项目(LJK-MZ20222083)*通信作者Tel:86-015084153381;E-mail:豆食品的黏液中和枯草芽孢杆菌(Bs u b t i l i s)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B.mega-terium)以及炭疽芽孢杆菌(B.anthrac
9、is)等的发酵培养基中分离得到了-PGA2.3。-PG A 的构象结构随溶液的pH值、浓度和离子强度变化而显著变化。由枯草芽孢杆菌生产-PGA在酸性溶液中具有平行的-折叠结构,在接近中性时具有无规则卷曲结构,在碱性环境中具有伸展的随机结构4接受日期:2 0 2 3-0 5-2 4-PGA成品为白色无味粉末状物质,其分子量在10 0 10 0 0 0 kDa之间,相当于50 50 0 0 0 个左右的谷氨酸单体5。-PGA 及其衍生物在诸多领Vol.35域具广泛的研究及应用前景。如作为食品保鲜剂6 、化妆品补水保湿成分7 、药物缓释载体8、重金属吸附剂及用于水处理的絮凝剂91等。2 0 13年,
10、有研究学者发现,-PGA通过降低 B16 细胞内活性氧和一氧化氮水平,提高过氧化氢酶活性,抑制 For-sklin诱导的酪氨酸酶活性和黑素生成。这是首次报道-PGA的抗黑素化作用。分子量是聚合物的重要特征参数,分子量的大小决定其应用领域和应用效果10 。因此,为了扩展-PGA的应用范围制备不同分子量-PGA,并研究不同分子量之间的活性差异具有重要意义。目前,微生物发酵法是常用的-PGA发酵方法。采用该法制备所得的-PGA分子量及产量受产生菌的影响。根据发酵过程中是否添加谷氨酸,将-PGA 的生产菌株分为谷氨酸依赖性菌株和非谷氨酸依赖性菌株两类。有研究表明采用谷氨酸依赖型菌株作为产生菌,-PGA
11、产量更高。因此,本文以枯草芽孢杆菌为发酵菌株,通过微生物发酵法生产-PGA。结合化学降解手段制备了五组不同分子量的-PGA,并对其胞内胞外抑制酪氨酸酶活性进行了研究。为不同分子量的-PGA作为美白剂在化妆品领域的应用奠定基础。1材料与方法1.1材料与仪器枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),山东丰金生物医药有限公司提供;酵母提取物(yeast extract,YE,100%,批号434516 1-0 2,0 XI0D);谷氨酸钠(纯度99%,批号C13501406,上海Macklin公司);MgS047H,0(A R,批号2 0 2 0 0 8 2 7,天津市永大化学试剂制造有限
12、公司);K,HPO4(A R,批号B2109241,西陇科学股份有限公司);琼脂粉(BR,批号2 0 190 7 0 6,青岛海博生物技术有限公司);氯霉素(纯度99%,批号No.821G046,北京Solarbio公司);酪氨酸酶(50 0units/mg,批号C14384601,上海Macklin公司);Na,SO4(纯度99%,批号L2117166,上海Aladdin公司);左旋多巴(纯度99%,批号C14100281,上海Macklin公司);L-酪氨酸(纯度9 9%,批号C13364528,上海Macklin公司);B16-F10小鼠黑色素瘤细胞,中国科学院细胞库;胎牛血清(批号P2
13、104403,上海泰坦科技股份有限公司);DMEM培养基(批号2 42 8 6 7 6,美国Gibco公司);青霉素-链霉素双抗(批号2 4418 34,美国Gibco公司);PBS磷酸盐缓冲液(AR,批号No.20220728,北京Solarbio公李想等:-聚谷氨酸的制备及其酪氨酸酶抑制活性研究国Malvern公司)。1.2实实验方法1.2.1-PGA发酵工艺以枯草芽孢杆菌为产生菌,以一定比例配制固体、种子及发酵培养基,通过菌种的平板活化、液体种子摇瓶、液体发酵摇瓶,得到-PGA发酵液。通过无水乙醇沉淀后,经进一步纯化除杂,最终得到固体-PGA。1.2.2培养基组分及培养方法固体培养基:葡
14、萄糖2 5g/L,谷氨酸钠10 g/L,YE 15 g/L,MgSO4 7H,0 0.25 g/L,K,HP04 2 g/L,琼脂 2 0 g/L;种子培养基:葡萄糖 2 5 g/L,谷氨酸钠10 g/L,YE 15 g/L,MgSO4 7H,0 0.25 g/L,K,HP042g/L;发酵培养基:葡萄糖2 5g/L,谷氨酸钠10 g/L,YE 15 g/L,MgS04.7H,0 0.25 g/L,K,HP04 2 g/L;pH6.87.0;装液量40%;灭菌条件:12 1高温高压湿热灭菌2 0 min,其中葡萄糖需单独灭菌,待灭菌完成后取出与其他成分混合均匀,在固体、种子及发酵培养基中分别加
15、人氯霉素抗性至终浓度为10ug/mL。培养方法:按照“Z”字划线法将菌种划在固体培养基上,在37 的生化培养箱中恒温倒置培养14 h。挑单菌落至装有种子培养基的摇瓶中,在37,2 0 0 r/m in 的培养条件下,恒温振荡培养18 h,达到对数生长期得到种子培养液。以5%的接种量将种子培养液接种至装有发酵培养基的摇瓶中,相同培养条件下,接续恒温振荡培养2 4h,得到-PGA发酵液。1.2.3产物纯化与表征1.2.3.1产物纯化将-PGA粗品按照一定比例复溶于水溶液中,1767司);0.2 5%胰蛋白酶(批号No.20221009,北京So-larbio公司);MTT(纯度99%,批号NO.5
16、30R058,美国Gibco公司);TritonX-100(纯度98%,批号No.404R022JH,北京Solarbio公司);曲酸(纯度99%,批号RH328769,北京Solarbio公司);葡萄糖(AR,批号2 0 150 6 30,国药集团);Na0H(A R,批号20211102,国药集团);DMSO(A R,批号2 0 2 2 0 6 14,国药集团);无水乙醇(AR,批号2 0 2 10 518,国药集团)。Vi-CELLXR型细胞计数仪(美国BeckmanCoulter公司);超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技有限公司);酶标仪(美国Molecular-Devices公司);
17、HPLC(美国Waters公司);凝胶渗透色谱仪(英1768调节pH为5.0,以30 g/L加人活性炭搅拌混匀,50水浴保温2 h,在10 0 0 r/min、2 0 m in 的条件下离心去除活性炭,经50 0 目硅藻土、2 0 0 目珍珠岩吸附除杂,再经0.45m滤膜过滤后,加人无水乙醇沉淀,4静置过夜,去上清,加无水乙醇反复脱水2次后,过滤收集沉淀,6 0 烘干至恒重,得到-PGA纯品。1.2.3.2产物表征参考Kambourova 等12 的方法,采用薄层色谱法,通过分析产物完全水解后的单体进行产物鉴别。精确称取0.5g干燥的-PGA纯品,放人具塞试管中,然后加人10 mL6 mol/
18、L 的HCl,振荡使其充分混匀,密封,110 水解2 4 h,待其冷却后调pH至6.8,定容至10 0 mL,配制成5mg/mL的样品水解液。另外分别取0.5g干燥的谷氨酸标准品和-PGA纯品,用纯化水充分溶解,定容至10 0 mL,配制成5mg/mL的谷氨酸标准品溶液和样品溶液。本实验中,采用酸性溶剂系统。展层剂的配置比例为正丁醇:8 0%甲酸:水=15:3:2(V/V/V)。在薄层层析硅胶板板上依次等距离点样样品溶液、谷氨酸标准溶液及样品水解液,冷风吹干,反复点样三次。展层50 6 0 min,以0.1%三酮-丙酮溶液做显色剂均匀喷洒层析板,热风吹干对比氨基酸斑点。1.2.4-PGA 产量
19、测定采用干重法测定产量,向等量的-PGA发酵液中,加人4倍体积无水乙醇沉淀,4静置过夜后抽滤取沉淀,6 0 烘干至恒重称量,计算产量。1.2.5-PGA纯度测定以Na,SO4作为流动相,以含量高于99%的-PGA作为标准品,对不同含量-PGA 标准溶液紫外吸收值进行检测。在检测柱温为30,检测波长为210nm,流速为0.5mL/min,进样量2 0 L的色谱条件下,采用高效液相色谱法测定,记录峰面积,并根据标准曲线计算得到样品溶液中-PGA 的浓度(c),以质量分数表示的-PGA含量按照公式(1)计算。-PGA 含量=10 0 10 式中,c:根据标准曲线计算得到的样品溶液中-PGA的浓度,g
20、/L;100:-PGA样品溶解的体积,mL;m:精确称取的-PGA样品的质量,g。天然产物研究与开发1.2.6-PGA 降解-PGA的结构易受温度和pH值的影响。因此,采用高温酸降的方式降解-PGA。配制4%的-PGA水溶液调节pH值为3.0,将其置于90 的水浴锅中进行酸性条件下的高温降解,分别降解15、30、45、6 0、7 5、90、10 5和12 0 min,降解结束后迅速冰浴使样品冷却至室温,调pH至中性(6.8 7.2),加4倍无水乙醇,以50 0 r/min的转速边搅拌边加醇,沉淀静置2 4h,弃上清后再加2 倍无水乙醇进行脱水,过滤收集沉淀,于6 0 烘干至恒重以除去乙醇残留,
21、收集沉淀样品。1.2.7-PGA分子量测定以0.3mol/LNa,SO4作为流动相,通过窄分布标准品获取仪器常数,宽分布标准品验证仪器常数。在检测柱温为30,流速为0.5mL/min,进样量100L的条件下通过检测-PGA样品在示差折光检测器下的出峰时间,利用GPC测定-PGA样品的分子量。1.2.8不同分子量-PGA胞外酪氨酸酶活性抑制率的测定人体内各类色素分布情况是影响人体皮肤正常状态的主要因素之一,其中黑色素的合成、分泌、转移以及脱落对于皮肤状态发挥着尤为重要的影响13。而酪氨酸酶是黑色素的合成途径中的关键酶。酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)是一种活性中心包含3个组氨酸(His)
22、残基和2 个 Cu离子的多功能酶,广泛存在于真菌、植物和动物中。它不仅可以氧化酪氨酸形成多巴,也可以继续氧化多巴形成多巴醌。多巴醌是一种高活性的物质,它可以和氨基酸或蛋白质发生反应形成高分子复合物或褐色素,最终形成黑色素。在TYR参与催化反应过程中,两步催化反应分别体现了酪氨酸酶单酚酶和二酚酶活性。1.2.8.1月胞外酪氨酸酶活性抑制率的测定参考Wang14的方法。将5组不同分子量的-PGA用0.0 5mol/LPBS缓冲液配成10 mg/mL的样品溶液,酪氨酸酶提前温浴5min后,按照表1依次添加各组分,其中A,为空白背景组、A2为空白组、A,为样品背景组、A4样品组。2 8 水浴恒温101
23、00%(1)mVol.35min后,利用酶标仪测定其在47 5nm处的吸光度值,酪氨酸酶的抑制率按照公式(2)进行计算。抑制率=1-A4-AA2-A100%(2)Vol.35L-酪氨酸 L-Tyrosine(1.5 mg/mL)PBS 缓冲液 PBS buffer(0.05 mol/L,pH 6.8)样品溶液 Sample solution(10 mg/mL)酪氨酸酶溶液tyrosinase solution(0.2mg/mL)合计 Total李想等:-聚谷氨酸的制备及其酪氨酸酶抑制活性研究表1酪氨酸酶活性抑制率测定Table 1Determination of tyrosinase acti
24、vity inhibition rate试剂ReagentA101600402001769组成 Composition(L)A2A32001401200404040200200A42010040402001.2.8.2胞外酪氨酸单酚酶抑制率测定参考Chen等15 的方法并稍做改动测定酪氨酸酶单酚酶抑制率。用0.0 5 mol/L PBS缓冲液将5组不同分子量的-PGA配成10 mg/mL的样品溶液,采用2 0 0 L的反应体系,酪氨酸酶溶液提前温浴5min后,按照表2 依次加入除酪氨酸酶溶液以外的各组分,酶标仪恒温2 8,加入酪氨酸酶溶液后立刻在47 5nm处连续测定吸光度值直至稳定不变。其中
25、(A4-A,)为添加样品的吸光度曲线,(A2-A,)为未添加样品的吸光度曲线。反应速率恒定阶段的直线与横轴截距为迟滞时间。酪氨酸单酚酶抑制率按照公式(3)计算。酪氨酸单酚酶抑制率=(1-竺式中,tA:添加样品的迟滞时间,min;tg:未添加样品的迟滞时间,min。1.2.8.3肘胞外酪氨酸二酚酶抑制率测定参考Ochiai等16 的方法并稍做改动。用0.0 5mol/L PBS缓冲液将5组不同分子量的-PGA配成10 mg/mL的样品溶液,将表2 中单酚酶的反应底物L-酪氨酸置换为二酚酶的反应底物左旋多巴,其余组分和条件保持不变,测定酪氨酸酶二酚酶抑制率。酶标仪恒温2 8,加人酪氨酸酶溶液后立刻
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