大叶杨干旱和水淹胁迫的转录组分析.pdf
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1、西北植物学报,2 0 2 3,4 3(1 0):1 6 5 3-1 6 6 2A c t a B o t.B o r e a l.-O c c i d e n t.S i n.d o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 0-4 0 2 5.2 0 2 3.1 0.1 6 5 3 h t t p:/x b z w x b.a l l j o u r n a l.n e t收稿日期:2 0 2 3-0 3-2 3;修改稿收到日期:2 0 2 3-0 7-1 0基金项目:国家重点研发计划项目(2 0 2 2 Y F D 2 2 0 1 2 0 0);国家自然科学基金项目(3
2、1 9 7 1 5 6 7)作者简介:张佳琪(1 9 9 8-),女,硕士研究生,主要从事野生动植物保护与资源利用研究。E-m a i l:z h a n g_j q 2 0 2 1o u t l o o k.c o m*通信作者:王 婧,教授,博士生导师,主要从事林木演化基因组学和遗传育种学研究。E-m a i l:w a n g j i n g 2 0 1 9s c u.e d u.c n大叶杨干旱和水淹胁迫的转录组分析张佳琪,张新新,冯佳珺,施婷婷,张钰麟,王 婧*(四川大学 生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都 6 1 0 0 0 0)摘 要:大叶杨(P o p u
3、l u s l a s i o c a r p a)是中国特有的杨属物种,干旱和水淹是影响大叶杨生长和分布范围的2个关键因子。A P 2/E R F转录因子家族在植物响应非生物胁迫中发挥重要作用。研究采用转录组测序、生物信息学分析手段并结合分子实验验证初步鉴定了参与大叶杨干旱和水淹胁迫响应的关键基因。研究结果显示,(1)在大叶杨中分别鉴定到3 9 8 6/3 8 5个响应干旱/水淹胁迫的差异表达基因,其中包括2 3 7个同时响应干旱和水淹胁迫的差异表达基因。(2)在大叶杨中共鉴定到2 0 5个A P 2/E R F家族成员,系统发育分析表明其在大叶杨中主要分为5个亚家族,并显著富集于差异表达基
4、因中。(3)筛选部分胁迫前后差异表达的P l A P 2/E R F基因进行q R T-P C R实验,经证实这些基因在大叶杨受到干旱/水淹胁迫时均可被诱导表达。综上,大叶杨在水淹胁迫下的差异表达基因数量明显少于干旱胁迫,A P 2/E R F基因家族的部分基因参与到大叶杨干旱/水淹胁迫的应激表达过程。关键词:大叶杨;A P 2/E R F;水淹胁迫;干旱胁迫;差异表达中图分类号:Q 7 8 6;Q 7 8 9;S 7 9 2.1 1文献标志码:AT r a n s c r i p t o m i c A n a l y s i s o f P o p u l u s l a s i o c
5、a r p a i n R e s p o n s e t o D r o u g h t a n d W a t e r l o g g i n g S t r e s sZ HANG J i a q i,Z HANG X i n x i n,F E NG J i a j u n,S H I T i n g t i n g,Z HANG Y u l i n,WANG J i n g*(K e y L a b o r a t o r y o f B i o-r e s o u r c e a n d E c o-e n v i r o n m e n t o f M i n i s t r y
6、 o f E d u c a t i o n,C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e,S i c h u a n U n i v e r s i t y,C h e n g d u 6 1 0 0 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:P o p u l u s l a s i o c a r p a i s a p o p l a r s p e c i e s o n l y l o c a l l y d i s t r i b u t e d i n C h i n a,a n d i t s g r o w t h a n
7、 d d i s-t r i b u t i o n r a n g e i s s e r i o u s l y c o n s t r a i n e d b y e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s s u c h a s d r o u g h t a n d w a t e r l o g g i n g.A P 2/E R F t r a n s c r i p t i o n f a c t o r f a m i l y p l a y s i m p o r t a n t r o l e s i n r e s p o n s e
8、 t o a b i o t i c s t r e s s e s i n p l a n t s.I n t h i s s t u d-y,w e i n t e g r a t e d t r a n s c r i p t o m e s e q u e n c i n g,b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s a n d e x p e r i m e n t a l v a l i d a t i o n t o i n v e s t i-g a t e g e n e s t h a t a r e l i k e l y t
9、 o b e i n v o l v e d i n r e s p o n s e s o f d r o u g h t a n d w a t e r l o g g i n g s t r e s s e s.T h e m a i n r e-s u l t s w e r e p r e s e n t e d a s f o l l o w s,(1)a t o t a l o f 3 9 8 6 a n d 3 8 5 d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s(D E G s)w e r e d e t e
10、c t e d u n d e r d r o u g h t a n d w a t e r l o g g i n g c o n d i t i o n s,r e s p e c t i v e l y,o f w h i c h 2 3 7 D E G s w e r e s h a r e d u n d e r d r o u g h t a n d w a t e r l o g g i n g s t r e s s e s.(2)A t o t a l o f 2 0 5 A P 2/E R F m e m b e r s w e r e i d e n t i f i e
11、 d i n P.l a s i o c a r-p a,w h i c h w e r e c l u s t e r e d i n t o f i v e s u b f a m i l i e s a n d s i g n i f i c a n t l y e n r i c h e d i n D E G s.(3)M u l t i p l e P l A P 2/E R F d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s t h a t a r e i n v o l v e d i n t h e r e s
12、p o n s e s t o d r o u g h t a n d w a t e r l o g g i n g s t r e s s e s w e r e f u r t h e r c o n f i r m e d b y q R T-P C R.I n c o n c l u s i o n,t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e n u m b e r o f D E G s u n d e r w a t e r l o g g i n g s t r e s s w e r e l e s s t h a n t h
13、a t u n d e r d r o u g h t s t r e s s i n P.l a s i o c a r p a.P l A P 2/E R F g e n e s w e r e h i g h l y i n v o l v e d i n t h e p r o c e s s o f a b i o t i c s t r e s s r e s p o n s e s.K e y w o r d s:P o p u l u s l a s i o c a r p a;A P 2/E R F;w a t e r l o g g i n g s t r e s s;d
14、r o u g h t s t r e s s;d i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n 大叶杨(P o p u l u s l a s i o c a r p a)是杨柳科(S a l i-c a c e a e)杨属(P o p u l u s)大叶杨组的落叶乔木,主要分布于中国湖北、四川、陕西、云南、贵州等地,生长在海拔1 3 0 01 5 0 0 m的山坡、灌丛等水资源较为丰富的区域1,是中国特有的杨属物种。相较于其他广域分布的杨属植物如山杨、银白杨、青杨等2,大叶杨的分布范围较为局限,这可能与其喜湿的生长习性有关。近年来,全球气候变暖导致
15、极端气候事件频发,这可能导致干燥地区变得更加干燥,潮湿地区则变得更加潮湿3。I P C C A R 6报告指出,在过去的5 0余年,全世界范围内强降水事件频发以及干旱事件增加4,而由此引发的干旱和洪水等自然灾害已经严重阻碍了中国林业建设与发展和生态环境的改善。因此在地区生境条件日益恶劣的背景下,培育抗逆性较强的树种并制定相应的保护和育种措施是恢复与重建生态系统平衡和提高林业生产力的重要方式。长期的洪涝会使得土壤含水量处于饱和状态,植物的有氧呼吸逐渐替换为无氧呼吸5,其形态结构、生长生理和新陈代谢等逐步受到影响6-8。如枫杨在水淹1 2 h后,体内类黄酮合成、亚麻酸、茉莉酸等代谢途径明显活跃9。
16、而缺水造成的干旱胁迫可能导致农作物和林木的减产,超过其他环境因子胁迫所造成减产的总和1 0。另外,缺水环境下也能够引起植物的叶子或幼果释放大量的乙烯,从而脱叶、落果1 1。植物也可通过增加体内的脱落酸含量以提高抗旱能力1 2。因此为了维持自身的生长发育,植物在分子水平上已进化出一系列响应非生物胁迫的机制。而外界的非生物胁迫也能影响植物体内功能基因和调控基因的表达1 3-1 4,其中就包括调控基因表达的众多转录因子家族成员1 5。A P 2/E R F转录因子家族在植物的生长发育、代谢以及生物和非生物胁迫的响应中发挥了关键作用1 6。根据A P 2/E R F结构域的数量以及是否含有其他结构域将
17、其分为5个亚家族1 7:A P 2、E R F(响应乙烯)、D R E B(与脱水响应元件结合)、R AV、S o l o i s t。A P 2亚家族含有2个串联重复的A P 2/E R F结构域;E R F和D R E B亚家族中只含有1个A P 2结构域,其共同特点是基因结构中内含子数量很少1 8,但是二者具有不同的作用,E R F亚家族主要与乙烯响应元件结合1 9,而D R E B亚家族,主要通过D R E/C R T顺式作用元件来调控基因的表达2 0;S o l o i s t亚家族也只含有1个A P 2/E R F结构域,但是核苷酸序列和基因结构与E R F等亚家族明显不同,并且核
18、苷酸序列在很多植物中高度保守1 7;R AV亚家族除了含有1个A P 2/E R F结构域外,还带 有1个B 3结构 域。A P 2亚家族主要在植物生长发育阶段起重要作用,例如开花2 1、种子生长与萌发2 2等;E R F主要作用于激素信号传导、非生物胁迫响应等2 3;R AV主要参与叶片衰老、生物与非生物胁迫响应调控2 4;S o-l o i s t在拟南芥中仅包含1个基因,调控水杨酸的合成以及防御细菌病原体的入侵2 5。目前对于大叶杨的研究多集中于种质资源调查和保存2 6,而对于大叶杨如何响应非生物胁迫以及其胁迫耐受能力研究鲜有报道。本研究通过对水淹和干旱胁迫后的大叶杨进行转录组测序,结合
19、生物信息学分析鉴定到一系列响应胁迫的差异表达基因,并发现大叶杨中A P 2/E R F转录因子家族成员在胁迫响应基因中显著富集,最后筛选出可能参与调控干旱或水淹胁迫耐受的候选基因。该研究结果将为今后深入探究极端水分环境下大叶杨的分子响应过程和适应性进化奠定基础,为大叶杨分子遗传育种提供理论参考。1 材料和方法1.1 试验材料大叶杨种子采集于四川省凉山彝族自治州美姑县瓦候乡(2 8 4 3 N,1 0 3 8 E),铺种萌发后移至温室进行培养,温室生长条件为:光照1 6 h,(2 51),黑暗8 h,(2 01),空气湿度在7 0%左右。待植株高度生长到3 04 0 c m时,挑选一部分进行预实
20、验以此确定水分胁迫时间(以出现表型变化但未枯死不影响测序为准),最终确定干旱胁迫时间为5 d,水淹胁迫为1 5 d。挑选出长势均匀良好的植株用于正式试验。1.2 胁迫处理正式试验将材料分为3组:水淹(w a t e r l o g g i n g s t r e s s,WS)处理组(水没过盆土3 c m左右)、干旱(d r o u g h t s t r e s s,D S)处理组(胁迫开始前保持正常浇水,胁迫开始后停止浇水,干旱胁迫结束时土壤含水量约在5 6%)以及对照(c o n t r o l g r o u p,C K)控制组(保持正常浇水,土壤含水量在7 0%8 0%)。为确保胁迫
21、结束的时间一致,于2 0 2 1年1 1月1 8日早上9:0 0先开始水淹胁迫处理,在水淹胁迫的第1 0天早上9:0 0 D S组材料停止浇水,开始干旱胁迫处理,期间保持所有处理组及对照组材料在相同环境,水淹处理组的水每3 d更换1次,以免微生物滋生干扰结果。4561西 北 植 物 学 报 4 3卷在水淹和干旱胁迫第3天和胁迫结束的最后一天采集样品,每组各取3株叶片材料用于转录组学测序,叶片统一取第56片新鲜的成熟叶片,并用液氮速冻后暂存于-8 0 冰箱。将试验样品材料送至深圳华大基因股份有限公司(h t t p s:/www.b g i.c o m/),使用T 7 P E 1 5 0平台进行
22、c D NA文库构建和R NA-S e q测序,每组处理的3株材料作为生物学重复。1.3 生物信息学分析原始测序数据(r a w r e a d s)先用F a s t Q C2 7检验数据质量,T r i mm o m a t i c2 8过滤接头及低质量 的r e a d s。过滤后的r e a d s用H I S AT 22 9比对到组装好的大叶杨参考基因组上,再用S t r i n g T i e3 0统计基因表达量,得到标准化后的T PM(t r a n s c r i p t s p e r k i l o b a s e o f e x o n m o d e l p e r m
23、 i l l i o n m a p p e d r e a d s)值。根 据 脚 本p r e p D E.p y(h t t p s:/g i t h u b.c o m/g p e r t e a/s t r i n g t i e/b l o b/m a s t e r/p r e p D E.p y)生成用于D E S e q 23 1差异表达分析的矩阵(c o u n t)文件,将错误发现率F D R(f a l s e d i s c o v e r y r a t e)0.0 5,差异倍数|l o g2 F D|1的基因定义为差异表达基因(d i f f e r e n t
24、i a l l y e x p r e s s e d g e n e s,D E G s)。t o p GO3 2包对D E G s进行GO富集分析。1.4 大叶杨A P 2/E R F转录因子家族分析在P f a m蛋 白 质 家 族 数 据 库(h t t p s:/p f a m-l e g a c y.x f a m.o r g/)下载A P 2保守结构域的蛋白序列(序列号:P F 0 0 8 4 7)HMM文件,HMM E R v 3.1 b 23 3(h t t p:/h mm e r.o r g/)鉴定大叶杨基因组数据库中的A P 2/E R F候选基因。S MA R T(h
25、t t p s:/s m a r t.e m b l.d e/)和N C B I C D D(h t t p s:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/c d d/)在线数据库对基因蛋白序列进行检测,保留有A P 2保守结构域的序列用于后续分析。在P l a n t T F D B植物转录因子数据库(h t t p:/p l a-n t t f d b.g a o-l a b.o r g/)中下载拟南芥A P 2/E R F基因家族成员的蛋白质序列。M u s c l e v 3.8.3 13 4对大叶杨和拟南芥的目的基因蛋白序列进行多序列比对,t r i-mA L v
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