miR-216b-5p通过靶向NCOA3促进胶质母细胞瘤细胞铁死亡.pdf
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1、miR-216b-5p 通过靶向 NCOA3 促进胶质母细胞瘤细胞铁死亡王东1),高必波2),孙会英1),冷登辉1),冉小平1),林文1)(1)资阳市人民医院神经疾病科,四川 资阳641300;2)昆明医科大学第一附属医院神经外科,云南 昆明650032)摘要 目的主要探讨 miR-216b-5p 通过靶向 NCOA3 对胶质瘤细胞铁死亡的影响,以期为胶质母细胞瘤的临床治疗提供新的靶点。方法U251 细胞分为 DMSO 处理组,Erastin 处理组,Erastin+mimic NC 组,Erastin+miR-216b-5p mimic 组,Erastin+pcDNA 3.1 组,Erast
2、in+pcDNA-NCOA3 组,pcDNA+miR-216b-5pmimic+pcDNA-NCOA3 组。通过实时荧光定量 PCR 检测和 Western blot 检测 miR-216b-5p 和 NCOA3 的表达以及铁死亡相关蛋白 PTGS2,NOX1,ACSL4,GPX4,FTH1 的蛋白表达量,CCK-8 和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡,通过试剂盒检测 MDA,亚铁(Fe2+),谷氨酰胺,谷氨酸,-酮戊二酸的含量。结果(1)miR-216b-5p 在人胶质母细胞瘤细胞株 LN229 和 U251 中均高表达,Erastin 刺激下的 U25 细胞活力回升且细胞凋亡率下降;(2)转染
3、 miR-216b-5p mimics 后,Erastin 刺激下的 U251 中的 MDA,亚铁(Fe2+),谷氨酰胺,谷氨酸,-酮戊二酸均有明显下降,铁死亡相关蛋白 PTGS2,NOX1,ACSL4 的蛋白表达量在 Erastin 的刺激下明显上升,而 GPX4,FTH1 的蛋白量明显下降;(3)获得 9 个在胶质母细胞瘤中与铁死亡相关,且与 miR-261b-5p 有直接靶向关系的基因,即 FOXO4,NCOA3,PARP8,PARP11,LIG3,MAPK9,TLR4,RB1,PTEN,miR-216b-5p与 NCOA3 直接结合向并负向调控 NCOA3;4.转染 NCOA3 使细胞
4、活力下降,MDA,亚铁(Fe2+),谷氨酰胺,谷氨酸,-酮戊二酸含量上升,铁死亡相关蛋白 PTGS2,NOX1,ACSL4 的蛋白表达量上升,而 GPX4,FTH1的蛋白量下降;但 miR-216b-5p mimic 的转染可逆转以上结果。结论miR-216b-5p 直接靶向 NCOA3,且通过 NCOA3 调控胶质母细胞瘤细胞的铁死亡,以此促进肿瘤的凋亡。对胶质母细胞瘤的新的治疗靶点以及后续研究提出了新的可能性,以期为胶质母细胞瘤的治疗提供新思路。关键词胶质母细胞瘤;miR-216b-5p;NCOA3;铁死亡中图分类号 R739.41 文献标志码 A 文章编号 2095 610X(2023)
5、08 0044 09miR-216b-5p Promotes Ferroptosis in Glioblastoma Cells byTargeting NCOA3WANG Dong1),GAO Bibo2),SUN Huiying1),LENG Denghui1),RAN Xiaoping1),LIN Wen1)(1)Dept.of Neuromedical Center,Ziyang Peoples Hospital of Sichuan Province,Ziyang Sichuan641300;2)Dept.of Neurosugery,First Affiliated Hospita
6、l of Kunming Medical University,Kunming Yunnan 650032,China)Abstract ObjectiveTo investigate the effect of miR-216b-5p on ferroptosis in glioblastoma cells bytargeting NCOA3,with a view to providing new targets for the clinical treatment of glioblastoma.MethodsU251cells were divided into DMSO-treate
7、d group,Erastin-treated group,Erastin+mimic NC group,Erastin+miR-216b-5p mimic group,Erastin+pcDNA 3.1 group,Erastin+pcDNA-NCOA3 group,pcDNA+miR-216b-5pmimic+pcDNA-NCOA3 group.The expression of miR-216b-5p and NCOA3 and the expression of ferroptosis-related proteins PTGS2,NOX1,ACSL4,GPX4,FTH1 were d
8、etected by real-time fluorescence quantitative PCR收稿日期20230419基金项目四川省资阳市科技计划项目(Zykjjsc20-yyjc-2020-07)作者简介王东(1985),男,四川资阳人,硕士,主治医师,主要从事脑胶质瘤,脑膜瘤,颅底肿瘤的分子靶向治疗等。通信作者林文,E-mail:昆明医科大学学报2023,44(8):4452JournalofKunmingMedicalUniversityDOI:10.12259/j.issn.2095-610X.S20230805CN531221/Rassay and Western blot,a
9、nd cell proliferation and apoptosis were detected by CCK-8 and flow cytometry,andMDA,Fe2+,glutamine,glutamic acid and -ketoglutarate by kit.Results miR-216b-5p was highlyexpressed in human glioblastoma cell lines LN229 and U251,and the viability of Erastin-stimulated U25 cellsincreased and the apopt
10、osis rate decreased.After transfection with miR-216b-5p mimics,MDA,Fe2+,glutamine,glutamic acid and -ketoglutarate were all decreased significantly,and the expression of ferroptosis-relatedproteins PTGS2,NOX1,and ACSL4 increased significantly upon Erastin stimulation,while the protein amount ofGPX4
11、and FTH1 decreased significant.9 genes associated with ferroptosis in glioblastoma and directly targeted tomiR-261b-5p were obtained,namely FOXO4,NCOA3,PARP8,PARP11,LIG3,MAPK9,TLR4,RB1,PTEN,miR-216b-5p,which directly bind to and negatively regulate NCOA3.Transfection with NCOA3 decreasedcell viabili
12、ty,MDA,Fe2+,glutamine,glutamic acid,-ketoglutarate levels,the protein expression of PTGS2,NOX1 and ACSL4 increased and that of GPX4 and FTH1 decreased;however,transfection of miR-216b-5p mimicreversed these results.Conclusion This study found that miR-216b-5p directly targets NCOA3 and regulatesferr
13、optosis in glioblastoma cells through NCOA3,thereby promoting apoptosis.This study suggests new therapeutictargets for glioblastoma as well as new possibilities for subsequent research,in order to provide new ideas for thetreatment of glioblastoma.Key words Glioblastoma;miR-216b-5p;NCOA3;Ferroptosis
14、胶质母细胞瘤(Glioblastoma)是成年人中枢神经系统中恶性程度最高且最常见的肿瘤1,目前的标准治疗方法为最大程度切除肿瘤后口服替莫唑胺联合全脑放射2。但是因其增殖快,侵袭性强,血管生成迅速丰富的特点,肿瘤的复发率接近 100%,5 a 总生存率为 5%3。因此,深入研究胶质瘤的发病机制以及潜在治疗靶向迫在眉睫。铁死亡(Ferroptosis)是一种非典型性程序性细胞死亡的方式,由脂质过氧化损伤引起34。由于癌细胞独特的代谢特征,铁死亡对肿瘤细胞的恶性生物学特征以及肿瘤的发展的影响逐渐引起人们的重视56。微小核糖核酸(microRNAs,miRNA)是大小约为 22 个核苷酸的转录本,在
15、细胞核和细胞质中通过多步过程产生,且被证实参与多种癌症的发生发展过程7。本文主要探讨 miR-216b-5p 通过靶向 NCOA3 对胶质瘤细胞铁死亡的影响,以期为胶质母细胞瘤的临床治疗提供新的靶点。1材料与方法1.1细胞培养人脑正常胶质细胞 HEB,人脑胶质母细胞瘤细 胞 株 LN299 和 U251 均 购 自 ATCC(Americantype culture collection)公司。细胞均培养在加入10%胎 牛 血 清 和 100 U/mL 青 霉 素-链 霉 素 的DMEM 培养基(购于武汉普诺赛)中,在 37,5%CO2 的培养箱中培养。U251 使用 DMSO 溶液充分溶解的
16、 Erastin 溶液(50 mg Erastin 粉末中加入 1.83 mL DMSO 溶液充分溶解成 50 mM 储存液,工作浓度为 5.47 g/g)或等体积 DMSO 溶液刺激,miR-216b-5p mimics,miR-216b-5p inhibitor,pcDNA-NCOA3 以及对应的阴性对照质粒均设计并构建自上海吉满生物科技,通过 LipofectamineTM 2000 agent(Invitrogen,美国)进行。U251 细胞分为 DMSO 处理组(等量 DMSO 刺激 24 h),Erastin 处 理 组(Erastin 刺 激 24 h),Erastin +mim
17、ic NC 组(转染 mimic NC 后 Erastin 刺激 24 h),Erastin+miR-216b-5p mimic 组(转染 miR-216b-5p mimic 后 Erastin 刺激 24 h),Erastin+pcDNA3.1 组(转 染 pcDNA 3.1 后 Erastin 刺 激 24 h),Erastin+pcDNA-NCOA3 组(转染 pcDNA-NCOA3后 Erastin 刺 激 24 h),pcDNA+miR-216b-5pmimic+pcDNA-NCOA3 组(共同转染 miR-216b-5p mimic 和 pcDNA-NCOA3 后 Erastin
18、刺激 24 h)。1.2RNA 以及蛋白表达检测各组细胞接种到 6 孔板后,加入 TRIZOL 裂解液提取总 RNA 后通过分光光度计检测 RNA 的浓 度 和 纯 度。使 用 Reverse Transcription Kits(TaKaRa,TRR820A)或 Bulge-Loop miRNA qRT-PCR Starter Kit(锐博,C10211-1)进行逆转录,SYBR premix Ex TaqTM 实时定量PCR 试剂盒(大连宝生物公司)进行 PCR 扩增并进行 qPCR 分析。mRNA 水 平 检 测 采 用 GAPDH 作 为 内 参 基 因,miRNAs 水平检测采用 U
19、6 作为内参基因。采用2CT 方法分析 mRNA 的相对表达水平,重复 3次实验。荧光定量 PCR 扩增引物序列见表 1。所第 8 期王 东,等miR-216b-5p 通过靶向 NCOA3 促进胶质母细胞瘤细胞铁死亡45有引物均由广州锐博生物有限公司设计并合成。使用 RIPA 法对细胞进行裂解,即将 RIPA 裂解液(含 0.01%PMSF、150 nmol/L Tris(pH=8)、0.1%SDS、0.2%EDTA、1%Triton X-100、1%脱氧胆酸钠)置于冰上 30 min 充分裂解细胞,通过BCA 蛋白质测定法(购于江苏凯基生物技术公司)对蛋白量进行测定,将等量蛋白(3050 g
20、)和2SDS 上样混合液混合并煮沸 5 min,10%SDS-PAGE 分离蛋白并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,美国)。将膜在室温下用 5%脱脂奶粉封闭后,与按比例稀释后的一抗(表 2)4 下孵育过夜,清洗后与二抗室温下孵育 2 h,通过增强化学发光法(Millipore,美国)使条带显色,GAPDH被用于内参基因。表2Western blot 中所用一抗Tab.2Primaryantibodiesusedinwesternblot一抗公司货号稀释比分子量种属PTGS2Abcamab1798001100069RabbitNOX1Abcamab1310881100065R
21、abbitACSL4Abcamab15528211000079RabbitGPX4Abcamab1250661100022RabbitFTH1Abcamab75972150021RabbitNCOA3Abcamab13361111000160RabbitGAPDHAbmartP30008M1100037Rabbit1.3细胞增殖凋亡检测将细胞以 3000 个细胞每孔的密度接种于 96孔板,每组 6 个复孔,每孔加入 100 L 含有 CCK-8 工作液(Abcam,批号 ab228554,工作液:培养基=110)的 DMEM 培养基,37 避光孵育,酶标仪检测 450 nm 处吸光度值。凋亡检
22、测试剂盒购于东仁化学,用预冷的 70%酒精固定细胞,并用 PBS 清洗。然后将细胞与 5 mL Annexin V-FITC 和 10 L PI 孵育 15 min,使用激发波长为488 纳米的流式细胞仪观察和分析凋亡细胞的比例。1.4生化指标检测取各组细胞,使用丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA 法)(南京建成 A003-1-2),铁检测试剂盒(abcam,ab83366),谷氨酸(Glu)含量测试盒(酶联 生 物,ml076520),谷 氨 酰 胺 检 测 试 剂 盒(abcam,ab197011),-酮戊二酸检测试剂盒(abcam,ab83431)按说明书制备样本,通过酶标仪分析 MDA
23、 水平,亚铁(Fe2+)水平,谷氨酰胺水平,谷氨酸水平,-酮戊二酸水平。1.5靶向预测及验证通过miRDB(https:/mirdb.org/)预测miR-216b-5p 的下游靶向基因,通过 FeffDb 数据库(http:/www.zhounan.org/ferrdb/current/)获取铁死亡相关基因,通过 GeneCards(https:/www.genecards.org/)获取胶质母细胞瘤相关基因,并使用 Venn 图(http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)获取共有基因,用 clusterProfiler 包进行 GO
24、富集。通过 miRDB 预测 miR-216b-5p 与 NCOA3 的结合靶 点,将 含 有 miR-216b-5p 的 野 生 或 突 变 型NCOA 3 质粒构建到 pRL-CMV 载体中,通过lipofectamine 2000 将WT-NCOA 3,Mut-NCOA 3,miR-216b-5p mimics,mimic NC 转染入U251 细胞,表1荧光定量 PCR 扩增引物列表Tab.1Nucleotidesequencesoftheprimersusedforreal-timequantitativePCR引物名称引物序列NCOA3forward5-AAGTGAAGAGGGAT
25、CTGGA-3NCOA3reverse5-CAGATGACTACCATTTGAGG-3miR-216b-5pforward5-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3miR-216b-5preverse5-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU-3.U6forward5-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3U6reverse5-CGAATTTGCGTGTCATCCTT-3GAPDHforward5-CGAATTTGCGTGTCATCCTT-3GAPDHreverse5-CGAATTTGCGTGTCATCCTT-346昆明医科大学学报第 44 卷并按照 Dual-Luc
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