miRNA-21的循环放大检测及成像.pdf
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1、 第4 4卷 第5期2 0 2 3年1 0月 青 岛 科 技 大 学 学 报(自然科学版)J o u r n a l o f Q i n g d a o U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y(N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n)V o l.4 4 N o.5O c t.2 0 2 3 文章编号:1 6 7 2-6 9 8 7(2 0 2 3)0 5-0 0 1 6-1 0;D O I:1 0.1 6 3 5 1/j.1 6 7 2-6 9 8 7.2 0 2
2、 3.0 5.0 0 2m i R N A-2 1的循环放大检测及成像孙鑫鑫,李家家,丁彩凤*(青岛科技大学 化学与分子工程学院,山东 青岛 2 6 6 0 4 2)摘 要:报道了一种m i R NA循环放大检测系统,该系统涉及红色发射碳量子点(C D s)以及聚多巴胺纳米球(P D AN S s)。通过纳米材料与D NA的自组装,在激发光源4 1 0、5 4 2 n m 的照射下,产生6 5 0、5 8 5 n m的荧光信号,通过荧光信号的关-开,可以实现对靶标m i R NA-2 1循环放大的双荧光检测与细胞成像,极大提高检测的灵敏度与准确性。关键词:碳量子点;聚多巴胺纳米球;m i R
3、NA-2 1;循环放大检测;细胞成像中图分类号:O 6 5 7.3 8 文献标志码:A引用格式:孙鑫鑫,李家家,丁彩凤.m i R NA-2 1的循环放大检测及成像J.青岛科技大学学报(自然科学版),2 0 2 3,4 4(5):1 6-2 5.S UN X i n x i n,L I J i a j i a,D I NG C a i f e n g.C i r c u l a t i n g a m p l i f i c a t i o n d e t e c t i o n a n d i m a g i n g o f m i R NA-2 1J.J o u r n a l o f Q
4、 i n g d a o U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y(N a t u r a l S c i e n c e E-d i t i o n),2 0 2 3,4 4(5):1 6-2 5.收稿日期:2 0 2 2-0 9-0 8基金项目:国家自然科学基金项目(2 2 0 7 4 0 7 4);山东省自然科学基金项目(Z R 2 0 2 0MB 0 6 5).作者简介:孙鑫鑫(1 9 9 6),女,硕士研究生.*通信联系人.C i r c u l a t i n g A m p l i f i c
5、a t i o n D e t e c t i o n a n d I m a g i n g o f m i R N A-2 1S U N X i n x i n,L I J i a j i a,D I N G C a i f e n g(C o l l e g e o f C h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r E n g i n e e r i n g,Q i n g d a o U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y,Q i n g d a o 2 6 6
6、 0 4 2,C h i n a)A b s t r a c t:T h i s p a p e r r e p o r t s s u c h a m i R NA c y c l e a m p l i f i c a t i o n d e t e c t i o n s y s t e m,w h i c h i n-v o l v e s r e d e m i t t i n g c a r b o n q u a n t u m d o t s(C D s)a n d p o l y d o p a m i n e n a n o s p h e r e s(P D AN S s
7、).T h r o u g h t h e s e l f-a s s e m b l y o f n a n o m a t e r i a l s a n d D NA,6 5 0 n m a n d 5 8 5 n m f l u o r e s c e n c e s i g-n a l s a r e g e n e r a t e d u n d e r t h e i r r a d i a t i o n o f 4 1 0 n m a n d 5 4 0 n m e x c i t a t i o n l i g h t s o u r c e s.T h r o u g h
8、 t h e o f f-o n o f f l u o r e s c e n c e s i g n a l s,t h e d o u b l e f l u o r e s c e n c e d e t e c t i o n a n d c e l l i m a-g i n g o f c y c l i c a m p l i f i c a t i o n o f t a r g e t m i R NA-2 1 c a n b e r e a l i z e d,w h i c h g r e a t l y i m p r o v e s t h e s e n s i
9、t i v i t y a n d a c c u r a c y o f d e t e c t i o n.K e y w o r d s:c a r b o n q u a n t u m d o t s;p o l y d o p a m i n e n a n o s p h e r e s;m i R NA-2 1;c y c l i c a m p l i f i c a-t i o n d e t e c t i o n;c e l l i m a g i n g 众所周知,m i R NA是一类非编码单链R NA,长度约为1 82 2个核苷酸1。m i R NA的类型有很多,
10、比如m i R NA-2 11-2、m i R NA-3 0 b3、m i R NA-1 2 24等。有很多研究报道,单个的m i R NA具有调节和抑制癌基因表达能力,m i R NA的部分缺失还会导致癌症的发生5。因此,越来越多的学者对于m i R NA进行了相关的实验研究与理论探讨,期望通过对m i R NA的研究实现对人体癌症的早起诊断与预防6。纳米材料碳量子点,在2 0 0 4年被首次发现7,它类似球形,其直径小于1 0 n m,通常包括C、H、O、N 4种基本元素8-9,其表面含有氨基、羧基、羟基等 第5期 孙鑫鑫等:m i R NA-2 1的循环放大检测及成像官能团1 0。C D
11、 s具有普通纳米材料没有的荧光性能,可以用于构建荧光探针。同时,C D s的毒性更低、亲水性更好、光稳定性更好,使得C D s可用于细胞成像,且红色发射的C D s使得具有更高的成像深度,具有一定的体内检测优势1 1。聚多巴胺纳米球(P D AN S s)也是当前备受关注的新型仿生材料,主要是多巴胺(D A)在水溶液中通过自身的氧化-聚合形成的1 2。不仅可以用作生物相容的荧光传感器和生物成像1 3,而且还可以通过能量转移或电子转移过程对邻近的荧光团产生显著的荧光猝灭效应1 4。将多种多功能纳米材料进行联合使用,更有助于提高对肿瘤标志物的检测效率,对于癌症的早起诊断与预防具有深远意义。本研究通
12、过合成两种多功能纳米材料,进而组装成为纳米探针,实现对肿瘤标志物m i R NA-2 1的相关检测及细胞成像。1 实验部分1.1 仪器与试剂高压釜,F C F-0.5型,郑州科达机械仪器设备有限公司;0.2 2 m的微孔滤膜过滤器,河南泰斯特仪器有限公司;透射电子显微镜,J EM-F 2 0 0型,日本电子株式会社;扫描电子显微镜,R e g u l u s 8 1 0 0型,锐力科技 股份有限公 司;紫外可见 分光光度计,UH 5 3 0 0型,日本日立高新技术公司;荧光分光光度计,F-4 6 0 0型,日本日立高新技术公司;激光粒度分布仪,WT N a n o Z s型,英国马尔文仪器有限
13、公司。柠檬酸钠(N a3C6H5O72 H2O)、盐酸多巴胺(C8H1 2C l NO2)、无水乙醇(C2H6O)、三羟甲基氨基甲烷(T r i s)、异 丙 醇(C3H8O)、4-二 甲 氨 基 吡 啶(DMA P)。D NA、m i R NA及多肽具体序列见表1所示。新鲜菠菜购自本地超市。表1 D N A、m i R N A和多肽的序列信息T a b l e 1 S e q u e n c e i n f o r m a t i o n o f D NA,m i R NA a n d p o l y p e p t i d e名称序列(5 -3)C OOH-s u bT T T T T T
14、 T T T T T C AA C A T C A G T C T GA T AA G C T A(B HQ 2)A C T C A C T A T r A G GAA GA GA T G G C GA G T T TT C T C G C C T T T T T T T T T T T T T G T GA G T(T AMR A-N)z y m eC T T A T C A GA C T GA T G T T GA(NH2)C T C G C C AT C T C T T C T C C GA G C C GA T C G G T C GAAA T A G T GA G Tm i RNA-
15、2 1UA G C UUAU C A GA C UGAUGUUGAm i R NA-1 4 1UAA C A C UGU C UG GUAAA GAUG Gm i R NA-1 5 5UUAAUG C UAAU C GUGAUA G G GUm i R NA-1 2 2UG GA GUGUGA C AAUG GUGUUUGm i RNA-l e t-7 aUGA G GUA GUA G GUUGUAUAGUUp o l y p e p t i d eA c p-P P P P E K E K E K E K1.2 实验过程1.2.1 红色发射C D s的合成及表征以新鲜菠菜叶为碳源,合成了具有
16、红色发射的C D s。取0.5 g去除茎脉的新鲜菠菜叶,加入5 m L 0.1 gm L-1的柠檬酸钠溶液,2 0 m L无水乙醇,水热法1 5 0 反应1 2 h后经0.2 2 m滤膜过滤,再经透析、纯化、冷冻干燥一系列过程,最终得到固体C D s。1.2.2 P D AN S s的合成及表征1 0 0 m L T r i s缓冲液(1 0 mm o lL-1)和4 0 m L异丙醇的混合物中加入0.1 g盐酸多巴胺,在黑暗中连续搅拌1 2 h,最终得到的溶液进行离心,水洗重复3次,最后对沉淀进行干燥后重新分散,之后进行P D AN S s的S EM、T EM、F T-I R、紫外、R a
17、m a n、抗污染等一系列表征。1.2.3 纳米探针的自组装过程等物质的量z y m e链与s u b链淬火(9 5 加热5 m i n,之后缓慢降至室温)后与C D s及连接抗污染多肽的P D AN S s进行混合,然后加入适量的DMA P(0.1 mm o lL-1)作为高效的酰化反应催化剂用于氨基与羧基的连接,静止1 2 h后离心去除未连接的D NA z y m e、C D s、P D AN S s及偶联剂。1.2.4 m i R NA-2 1的检测与细胞成像将自 组 装 的 纳 米 探 针 与 靶 标m i R NA-2 1及M g2+体外反应一段时间后,分别测不同浓度、不同时间下的荧
18、光强度变化,之后进行细胞成像。1.3 实验原理体内外检测过程原理见图1,首先合成了C D s和P D AN S s两种纳米材料,其中P D AN S s既可以作为C D s的荧光猝灭剂,又可作为材料载体,保证纳米复合材料可以顺利进入到细胞中。同时表面连接的抗污染多肽,可以提高纳米材料在检测过程的抗污染效果,避免受到其他蛋白的干扰,影响实验测71青 岛 科 技 大 学 学 报(自然科学版)第4 4卷图1 体内外检测过程原理图F i g.1 S c h e m a t i c d i a g r a m o f i n v i v o a n d i n v i t r o d e t e c t
19、 i o n p r o c e s s定。C D s与P D AN S s、D NA通过酰胺键进行连接,此时C D s与T AMR A-N的荧光通过荧光共振能量转移分别被P D AN S s及B HQ 2猝灭,并无荧光信号。在m i R NA-2 1存在的情况下,D NA s u b链与m i R NA-2 1链进行配对的碱基数更多、结合力更强,可实现与m i R NA-2 1链的特异性结合,导致D NA s u b-z y m e链解离,实现C D s 6 5 0 n m发射处的红色荧光恢复。游离的D NA z y m e链会在M g2+存在的条件 下 实 现 对D NA s u b链 的
20、 特 异 性 切 割,导 致T AMR A-N 5 8 0 n m处 的 橙 色 荧 光 恢 复。之 后D NA z y m e链进一步进行游离,实现另外D NA s u b链的切割,从而达到信号检测的循环放大效果,提高检测的灵敏度,而且双荧光检测可以提高检测结果的准确性。2 结果与讨论2.1 C D s的相关表征2.1.1 C D s的形貌及拉曼表征通过水热法合成了具有红色发射的C D s,并对其进行了形貌、粒径、电位、官能团等一系列表征,见图2图5。以菠菜叶、乙醇、柠檬酸钠为原料,合成了C D s。图2 为C D s在 不 同 标 尺 下 的 透 射 电 子 显 微 镜(T EM)图像。由
21、图2可以看出,所制备的纳米材料C D s为分散均匀的球形结构,粒径在27 n m。插图为C D s的高分辨率透射电子显微镜(HR T EM)。可以看出,所制备的C D s具有分辨率良好的晶格条纹,平面间距为0.2 3 n m。图3为C D s的动态光散射水合半径分布图。结果显示粒度分布主要集中在1 0 n m左右的范围内,相比较干燥后的样品所进行的透射电镜成像来说,水合粒径因其表面电荷对溶液中H+、OH-的吸附,使得所测得的粒径结果较透射电镜显示的粒子半径大些。然后对C D s的合成进行了拉曼光谱表征,以验证C D s的成功制备见图4。如图4所示,在1 3 6 9,1 5 6 3 c m-1处
22、显示出了C D s的典型拉曼峰,其中1 3 6 9 c m-1属于D带,归因于无定形碳,表示C原子的晶格缺陷,而1 5 6 3 c m-1属于G带,归因于石墨碳,表示C原子s p2杂化的面内伸缩振动。图4拉曼光谱显示了C D s在D带与G带的典型拉曼峰,表明了所制备的C D s含有两种类型的碳物种,证明了C D s的成功合成。81 第5期 孙鑫鑫等:m i R NA-2 1的循环放大检测及成像图2 C D s的T EM照片F i g.2 T EM i m a g e s o f C D s图3 C D s的D L S粒度表征F i g.3 S i z e d i s t r i b u t i
23、 o n o f C D s图4 C D s的R a m a n光谱表征F i g.4 R a m a n i m a g e s o f C D s2.1.2 C D s的红外光谱表征利用红外光谱对C D s的化学组成和成键进行了进一步的表征,见图5。从图5可以看出C D s的主要成键组成,其表面含有多种官能团。其中,在3 4 2 7 c m-1的吸收带对应于NH的 伸 缩 振 动,2 9 7 5,2 9 2 5,2 8 6 5和1 4 6 0 c m-1处比较宽的吸收带归因于CH、CH2、CH3的伸缩和弯曲振动,1 6 1 6 c m-1处比较尖锐的吸收 带 被 指 定 为CC/CN的 伸
24、 缩 振 动,而1 3 8 6,1 3 7 5 c m-1处的宽吸收带及1 2 2 7 c m-1处的吸收带归因于CN的伸缩振动,1 0 8 0 c m-1处的吸收带是由COC的伸缩振动引起的。以上的红外数据表明,C D s表面含有大量的氨基,便于后面对纳米材料进行表面修饰。图5 C D s的红外光谱表征F i g.5 F T-I R s p e c t r u m o f C D s2.1.3 C D s的相对荧光量子产率测定对于C D s的相对荧光量子产率进行了测定与计算,选择以硫酸奎宁为标准,通过测定硫酸奎宁与C D s的荧光与紫外吸收,对C D s的相对荧光量子产率进行计算。硫酸奎宁的
25、紫外吸收光谱和荧光光谱见图6和图7。C D s的紫外吸收光谱和C D s的荧光光谱见图8和图9。图6 硫酸奎宁的紫外吸收光谱F i g.6 U l t r a v i o l e t a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f q u i n i n e s u l f a t e91青 岛 科 技 大 学 学 报(自然科学版)第4 4卷通过公式Yu=YsFu/FsAs/Au计算出,C D s红色发射的相对荧光量子产率为1 3.3%。图7 硫酸奎宁的荧光光谱F i g.7 F l u o r e s c e n c e s p e c t r u m o f
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