远隔缺血预适应通过激活HIF-1α_VEGF通路保护大鼠缺血性脑卒中.pdf
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1、Chinese Journal of Neuroanatomy志杂解部经神2023,39(3):341345远隔缺血预适应通过激活HIF-1/VEGF通路保护大鼠缺血性脑卒中邹正,付丽丽,费爽,石佐林,冯思哲*(中国人民解放军北部战区总医院神经外科,沈阳110 0 16)【摘要目的:研究远隔缺血预适应(RIPC)对大鼠脑缺血模型的保护作用及分子机制。方法:30 只成年雄性SD大鼠随机分为4组:假手术组(sham)、RIPC组、缺血再灌注组(MCAO/R)组、RIPC+MCAO/R组;术前通过夹闭双侧股动脉给予相应组RIPC处理,利用大脑中动脉栓塞再灌注法(MCAO/R)制备大鼠缺血性脑卒中模型
2、,神经功能评分检测大鼠的神经功能,用2,3,5-三苯四唑氯(TTC)对脑切片进行染色以评估脑梗死的程度。利用realtimeRT-PCR检测大脑皮质中低氧诱导因子-1(H IF-1)和血管内皮生长因子(VECF)mRNA 的表达。结果:与MCAO/R组大鼠相比,RIPC处理组大鼠神经功能缺损症状较轻(P0.05),脑梗死体积缩小(P0.01),皮质中HIF-1和VECFmRNA的表达表达明显升高(P0.05)。结论:RIPC处理对减轻缺血性脑卒中大鼠具有保护作用,其分子机制可能与激活HIF-1/VECF通路有关。关键词远隔缺血预适应;大脑中动脉栓塞;缺血性脑卒中;低氧诱导因子-1;血管内皮生长
3、因子;大鼠D0I:10.16557/ki.1000-7547.2023.03.014Remote ischemic preconditioning protects ischemic strokein rats by activating HIF-1/VEGF pathwayZOU Zheng,FU Lili,FEI Shuang,SHI Zuolin,FENG Sizhe(Department of Neurosurgery,General Hospital of Northern Theater Command ofChinese Peoples Liberation Army,Sheny
4、ang 110016,China)Abstract Objective:To study the protective effect of remote ischemic preconditioning(RIPC)on ischemic strokemodel rats and its molecular mechanism.Methods:Thirty adult male SD rats were randomly divided into 4 groups:Sham operation group(sham),RIPC group,middle cerebral artery occlu
5、sion-reperfusion(MCAO/R)group,and RIPC+MCAO/R group.Before surgery,the rats were treated with RIPC by clamping bilateral femoral arteries,and ischemicstroke was prepared by MCAO/R.Neurological function score was used to detect the neurological function of the rats,and brain sections were stained wit
6、h 2,3,5-tribenzoltetrazolol(TTC)to evaluate the degree of cerebral infarction.ThemRNA expression of hypoxia inducible factor-1(HIF-1)and vascular endothelial growth factor(VEGF)was detec-ted by real time RT-PCR.Results:Compared with MCAO/R group,RIPC+MCAO/R group of rats ameliorated ische-mic stroke
7、-induced neurological deficiency(P0.05),reduced cerebral infarction volume(P0.01),and signifi-cantly increased the mRNA expression of HIF-1 and VEGF in cortex(P0.05).Conclusion:RIPC treatment has aprotective effect on ischemic stroke in rats,and its molecular mechanism may be related to the activati
8、on of HIF-1VECF pathway.基金项目:国家自然科学基金(8 2 0 7 148 1)*通信作者:冯思哲电话:1338 6 8 99997,E-mail:fengsizhe 3422023年5月第39 卷第3期神经解剖学杂志,Key wordsremote ischemic preconditioning(RIPC);middle cerebral artery occlusion-reperfusion(MCAO/R);ischemic stroke;hypoxia inducible factor-1(HIF-1);vascular endothelial growth
9、factor(VEGF);rat缺血性脑卒中的基本病理原因是血管内血栓形成,可导致脑组织坏死和局灶性神经元缺损,缺血性脑卒中占全球死亡人数的5.2%。缺血性中风有3种已知的主要原因:50%是由脑血管动脉硬化斑块和动脉硬化斑块破裂引起的,2 0%是由心源性脑梗死引起的,2 5%是由小血管病变引起的腔隙性梗死引起的。此外,剩下的5%是由于其他特殊原因,如血管炎和颅外动脉夹层2 4。缺血引起的血管阻塞会过度产生活性氧(reactive oxygen species,ROS),引起氧化应激反应。研究表明氧化应激会加重神经元损伤,导致严重的功能缺陷5.6 。迄今为止,缺血性脑卒中的有效治疗方法有限,迫切
10、需要创新的治疗方法。远隔缺血预适应(remote ischemic precondition-ing,RIPC)是指通过对非重要器官(比如四肢)进行重复缺血/再灌注预处理,可以增加远隔的重要器官(如心脏和脑)起到保护作用7.8 。尽管进行了深人的研究,但关于RIPC介导保护的机制,仍然明显缺乏全面的认识。本研究我们通过夹闭股动脉的方法对大鼠进行RIPC适应性处理,然后利用大脑中动脉栓塞再灌注(middle cerebral artery occlusion-reperfu-sion,M CA O/R)方法制备大鼠脑缺血模型,观察RIPC对缺血性脑卒中的保护作用。材料和方法1.材料1.1实验动物
11、SPF级SD雄性大鼠,体重2 50 300g,购自沈阳艾科赛斯生物科技有限公司,饲养环境维持12 h昼夜节律交替,自由摄食和饮水。按照随机数字法分为4组,分别是:假手术组(sham)、RIPC处理组(RIPC)、大脑中动脉栓塞再灌注组(MCAO/R)组、RIPC+MCAO/R组。1.2试剂和仪器TRIzolTM试剂购自北京索莱宝生物有限公司,SYBRGreen实时定量RT-PCR试剂盒购自美国ThermoFisher公司,TTC染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,大鼠MCAO手术用线栓购自北京西浓科技有限公司,引物由上海生工生物有限公司合成。2.方法2.1远端缺血预适应处理:RIPC处理
12、组和MCAO/R+RIPC组的大鼠2%异氟烷麻醉后,仰卧位固定于手术台上,消毒后分离出双侧股动脉并给予15min夹闭/15min再通,进行3个循环92.2大脑中动脉闭塞模型制备大鼠用2%的异氟烷麻醉,仰卧位固定在手术台上,消毒后从颈前正中线剪开皮肤,分离出左侧颈动脉鞘,分离颈外动脉,先头端钝性分离只甲状腺动脉发出位置,在该处结扎并切断颈外动脉,血管钳暂时夹闭颈内动脉,颈动脉近心端做一斜型切口,将带有硅胶头的专用线栓从切口插人约18 mm,遇阻力后再推进少许,1h后抽出线栓,进行再灌注,结扎颈外动脉近心端的切口,缝合皮肤切口,待大鼠完全苏醒后放回笼中饲养10 O2.3神经功能评分个在MCAO手术
13、后48 h根据改良的Garcia评分系统 评估大鼠神经功能。为排除主观因素干扰,观察者对分组情况和手术过程未知,观察指标包括如下:大鼠在笼子中的自发活动,四肢运动的对称性,前爪伸展的对称性,攀爬铁丝网能力,触碰躯干后的反应,触碰触须后的反应。各单向测试的分数总和为总的神经功能评分,神经学评分最低为3分,最高为18 分,评分越低说明神经功能损害越严重 2.4TTC染色每组5只大鼠,断头处死,迅速取出完整大脑,用脑切片机从额叶顶端切成7 片2 mm厚的冠状切片。然后将切片在37 下浸泡于浓度为1%的2,3,5-三苯四氯化铵(2,3,5-tribenzoltet-razolol,T T C)溶液中孵
14、育15min,用PBS清洗后拍照。利用图像处理软件ImageJ测量每个脑片的梗死面积,每层梗死体积为该层梗死面积和层厚的乘积,各层的梗死体积之和即为总的梗死体积。2.5RNA提取和real time RT-PCR每组取5只动物,异氟烷麻醉处死后取出大脑,在每只大鼠大脑半球上外侧面相同位置取10 0 mg皮层组织,用TRIzol试剂提取组织总RNA,紫外分光光度计定量,反转录成cDNA,引物序列,低氧诱导因子-1(h y p o x i a i n-ducible factor-1,H IF-1)上游引物5-TTTCTCT-GCGCGTGAGGAC-3,5-CGACGTTCGGAACTCATC-
15、CT-3;血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEG F)上游引物5-TACTGCTGTACCTCCAC-邹343正:远隔缺血预适应通过激活HIF-1/VEGF通路保护大鼠缺血性脑卒中CTCCACCATG-3下游引物5-TCACTTCATGGGACT-TCTCCTCT-3;内参照基因GAPDH上游引物5-GA-CATGCCGCCTGGAGAAAC-3,下游引物5-AGC-CCAGGATGCCCTTTAGT3。1lcDNA模板与10 lSYBRGreenPCRMasterMix、1l上下游引物和7l去离子水混合。混合物在95下反应6 0 s,在9
16、5下反应15s,55下反应30 s,7 2 下反应35s进行40 个循环。最后,在95反应30 s,55反应35s,以 GAPDH 为内参,采用 2-ACt方法计算基因相对表达量。2.6乡统计学分析数据以均数标准差(x土s)表示,所有数据均使用SPSS26进行分析。采用单因素方差分析(onewayANOVA),P 0.0 5认为有统计学意义。结果远隔缺血预适应改善脑缺血模型大鼠神经功能MCAO手术检测各组大鼠的神经功能,与假手术组相比,MCAO组大鼠神经功能缺损评明显,主要表现为,肢体不对称,肌张力下降,自发活动减少等,而经过RIPC处理的大鼠,MCAO手术后期神经功能较未处理组的大鼠明显好转
17、(P0.05,Fig.1)。表明RIPC处理可以改善脑缺血模型大鼠神经功能。2015b10a50ShamRIPCMCAO/RRIPC+MCAO/RFig.1 Neurological function score in rats.aP 0.05 us Shamgroup,bP0.05 us MACO/R group.2.远隔缺血预适应减少脑缺血模型大鼠梗死体积MCAO手术7 2 h,用TTC染色观察比较各组大鼠脑梗死体积,与单纯MCAO组相比,经过RIPC处理的大鼠,其脑梗死体积显著减小(P0.01,Fig.2)。RIPC+ShamRIPCMCAO/RMCAO/R200a150100b500S
18、hamRIPCMCAO/RRIPC+MCAO/RABFig.2 Degree of cerebral infarction in rats.A:Representative micrographs of TTC-stained brain sections of rats.B:Infarct volumequantitation.“P0.01 us Sham group,bP0.01 s MACO/R group.3.远隔缺血预适应增加脑缺血模型大鼠皮质HIF-1和VEGFmRNA表达HIF-1是调节细胞缺氧适应的关键转录因子,VEGF是调节血管生成的重要分子,缺血性疾病可以引起HIF-1/V
19、ECF信号通路的激活。与单纯MCAO/R组相比,RIPC处理的大鼠皮质中HIF-1和VECF表达明显上调(P0.05,Fig.3)。讨论由于大多数缺血性卒中(约8 0%)发生在大脑中动脉所支配的脑区,许多动物卒中模型的建立都集中在该动脉上12 。MCAO的腔内栓塞模型涉及将线栓插人颈外动脉并将其向前穿入颈内动脉,直到尖端阻塞大脑中动脉的起始部,导致血流停止并3442023年5月第39 卷第3期神经解部学杂志,3.0HIF-1bVEGFb2.52.0aa1.51.00.50.0ShamRIPCMCAO/RRIPC+MCAO/RFig.3 The expression of HIF-1 and V
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