远隔缺血预适应通过激活HIF-1α_VEGF通路保护大鼠缺血性脑卒中.pdf

Chinese Journal of Neuroanatomy志杂解部经神2023,39(3):341345远隔缺血预适应通过激活HIF-1/VEGF通路保护大鼠缺血性脑卒中邹正，付丽丽，费爽，石佐林，冯思哲*（中国人民解放军北部战区总医院神经外科，沈阳110 0 16）【摘要目的：研究远隔缺血预适应(RIPC)对大鼠脑缺血模型的保护作用及分子机制。方法：30 只成年雄性SD大鼠随机分为4组：假手术组（sham）、RIPC组、缺血再灌注组（MCAO/R）组、RIPC+MCAO/R组；术前通过夹闭双侧股动脉给予相应组RIPC处理，利用大脑中动脉栓塞再灌注法（MCAO/R）制备大鼠缺血性脑卒中模型，神经功能评分检测大鼠的神经功能，用2,3,5-三苯四唑氯（TTC)对脑切片进行染色以评估脑梗死的程度。利用realtimeRT-PCR检测大脑皮质中低氧诱导因子-1（H IF-1）和血管内皮生长因子（VECF）mRNA 的表达。结果：与MCAO/R组大鼠相比,RIPC处理组大鼠神经功能缺损症状较轻（P0.05），脑梗死体积缩小（P0.01），皮质中HIF-1和VECFmRNA的表达表达明显升高（P0.05）。结论：RIPC处理对减轻缺血性脑卒中大鼠具有保护作用，其分子机制可能与激活HIF-1/VECF通路有关。关键词远隔缺血预适应；大脑中动脉栓塞；缺血性脑卒中；低氧诱导因子-1；血管内皮生长因子；大鼠D0I:10.16557/ki.1000-7547.2023.03.014Remote ischemic preconditioning protects ischemic strokein rats by activating HIF-1/VEGF pathwayZOU Zheng,FU Lili,FEI Shuang,SHI Zuolin,FENG Sizhe(Department of Neurosurgery,General Hospital of Northern Theater Command ofChinese Peoples Liberation Army,Shenyang 110016,China)Abstract Objective:To study the protective effect of remote ischemic preconditioning(RIPC)on ischemic strokemodel rats and its molecular mechanism.Methods:Thirty adult male SD rats were randomly divided into 4 groups:Sham operation group(sham),RIPC group,middle cerebral artery occlusion-reperfusion(MCAO/R)group,and RIPC+MCAO/R group.Before surgery,the rats were treated with RIPC by clamping bilateral femoral arteries,and ischemicstroke was prepared by MCAO/R.Neurological function score was used to detect the neurological function of the rats,and brain sections were stained with 2,3,5-tribenzoltetrazolol(TTC)to evaluate the degree of cerebral infarction.ThemRNA expression of hypoxia inducible factor-1(HIF-1)and vascular endothelial growth factor(VEGF)was detec-ted by real time RT-PCR.Results:Compared with MCAO/R group,RIPC+MCAO/R group of rats ameliorated ische-mic stroke-induced neurological deficiency(P0.05),reduced cerebral infarction volume(P0.01),and signifi-cantly increased the mRNA expression of HIF-1 and VEGF in cortex(P0.05).Conclusion:RIPC treatment has aprotective effect on ischemic stroke in rats,and its molecular mechanism may be related to the activation of HIF-1VECF pathway.基金项目：国家自然科学基金（8 2 0 7 148 1）*通信作者：冯思哲电话：1338 6 8 99997,E-mail:fengsizhe 3422023年5月第39 卷第3期神经解剖学杂志，Key wordsremote ischemic preconditioning(RIPC);middle cerebral artery occlusion-reperfusion(MCAO/R);ischemic stroke;hypoxia inducible factor-1(HIF-1);vascular endothelial growth factor(VEGF);rat缺血性脑卒中的基本病理原因是血管内血栓形成，可导致脑组织坏死和局灶性神经元缺损，缺血性脑卒中占全球死亡人数的5.2%。缺血性中风有3种已知的主要原因：50%是由脑血管动脉硬化斑块和动脉硬化斑块破裂引起的，2 0%是由心源性脑梗死引起的,2 5%是由小血管病变引起的腔隙性梗死引起的。此外，剩下的5%是由于其他特殊原因，如血管炎和颅外动脉夹层2 4。缺血引起的血管阻塞会过度产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），引起氧化应激反应。研究表明氧化应激会加重神经元损伤，导致严重的功能缺陷5.6 。迄今为止，缺血性脑卒中的有效治疗方法有限，迫切需要创新的治疗方法。远隔缺血预适应（remote ischemic precondition-ing,RIPC)是指通过对非重要器官（比如四肢）进行重复缺血/再灌注预处理，可以增加远隔的重要器官（如心脏和脑)起到保护作用7.8 。尽管进行了深人的研究，但关于RIPC介导保护的机制，仍然明显缺乏全面的认识。本研究我们通过夹闭股动脉的方法对大鼠进行RIPC适应性处理，然后利用大脑中动脉栓塞再灌注(middle cerebral artery occlusion-reperfu-sion，M CA O/R）方法制备大鼠脑缺血模型，观察RIPC对缺血性脑卒中的保护作用。材料和方法1.材料1.1实验动物SPF级SD雄性大鼠，体重2 50 300g，购自沈阳艾科赛斯生物科技有限公司，饲养环境维持12 h昼夜节律交替，自由摄食和饮水。按照随机数字法分为4组，分别是：假手术组（sham）、RIPC处理组（RIPC）、大脑中动脉栓塞再灌注组(MCAO/R)组、RIPC+MCAO/R组。1.2试剂和仪器TRIzolTM试剂购自北京索莱宝生物有限公司，SYBRGreen实时定量RT-PCR试剂盒购自美国ThermoFisher公司，TTC染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，大鼠MCAO手术用线栓购自北京西浓科技有限公司，引物由上海生工生物有限公司合成。2.方法2.1远端缺血预适应处理：RIPC处理组和MCAO/R+RIPC组的大鼠2%异氟烷麻醉后，仰卧位固定于手术台上，消毒后分离出双侧股动脉并给予15min夹闭/15min再通,进行3个循环92.2大脑中动脉闭塞模型制备大鼠用2%的异氟烷麻醉，仰卧位固定在手术台上，消毒后从颈前正中线剪开皮肤，分离出左侧颈动脉鞘，分离颈外动脉，先头端钝性分离只甲状腺动脉发出位置，在该处结扎并切断颈外动脉，血管钳暂时夹闭颈内动脉,颈动脉近心端做一斜型切口，将带有硅胶头的专用线栓从切口插人约18 mm，遇阻力后再推进少许，1h后抽出线栓，进行再灌注，结扎颈外动脉近心端的切口，缝合皮肤切口，待大鼠完全苏醒后放回笼中饲养10 O2.3神经功能评分个在MCAO手术后48 h根据改良的Garcia评分系统 评估大鼠神经功能。为排除主观因素干扰，观察者对分组情况和手术过程未知,观察指标包括如下：大鼠在笼子中的自发活动，四肢运动的对称性，前爪伸展的对称性，攀爬铁丝网能力，触碰躯干后的反应，触碰触须后的反应。各单向测试的分数总和为总的神经功能评分，神经学评分最低为3分，最高为18 分，评分越低说明神经功能损害越严重 2.4TTC染色每组5只大鼠，断头处死，迅速取出完整大脑，用脑切片机从额叶顶端切成7 片2 mm厚的冠状切片。然后将切片在37 下浸泡于浓度为1%的2,3,5-三苯四氯化铵（2,3,5-tribenzoltet-razolol，T T C）溶液中孵育15min，用PBS清洗后拍照。利用图像处理软件ImageJ测量每个脑片的梗死面积，每层梗死体积为该层梗死面积和层厚的乘积，各层的梗死体积之和即为总的梗死体积。2.5RNA提取和real time RT-PCR每组取5只动物，异氟烷麻醉处死后取出大脑，在每只大鼠大脑半球上外侧面相同位置取10 0 mg皮层组织，用TRIzol试剂提取组织总RNA，紫外分光光度计定量，反转录成cDNA，引物序列，低氧诱导因子-1（h y p o x i a i n-ducible factor-1，H IF-1）上游引物5-TTTCTCT-GCGCGTGAGGAC-3,5-CGACGTTCGGAACTCATC-CT-3;血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor，VEG F）上游引物5-TACTGCTGTACCTCCAC-邹343正：远隔缺血预适应通过激活HIF-1/VEGF通路保护大鼠缺血性脑卒中CTCCACCATG-3下游引物5-TCACTTCATGGGACT-TCTCCTCT-3;内参照基因GAPDH上游引物5-GA-CATGCCGCCTGGAGAAAC-3，下游引物5-AGC-CCAGGATGCCCTTTAGT3。1lcDNA模板与10 lSYBRGreenPCRMasterMix、1l上下游引物和7l去离子水混合。混合物在95下反应6 0 s，在95下反应15s，55下反应30 s，7 2 下反应35s进行40 个循环。最后，在95反应30 s，55反应35s,以 GAPDH 为内参,采用 2-ACt方法计算基因相对表达量。2.6乡统计学分析数据以均数标准差（x土s）表示，所有数据均使用SPSS26进行分析。采用单因素方差分析（onewayANOVA），P 0.0 5认为有统计学意义。结果远隔缺血预适应改善脑缺血模型大鼠神经功能MCAO手术检测各组大鼠的神经功能，与假手术组相比，MCAO组大鼠神经功能缺损评明显，主要表现为，肢体不对称，肌张力下降，自发活动减少等，而经过RIPC处理的大鼠，MCAO手术后期神经功能较未处理组的大鼠明显好转（P0.05,Fig.1）。表明RIPC处理可以改善脑缺血模型大鼠神经功能。2015b10a50ShamRIPCMCAO/RRIPC+MCAO/RFig.1 Neurological function score in rats.aP 0.05 us Shamgroup,bP0.05 us MACO/R group.2.远隔缺血预适应减少脑缺血模型大鼠梗死体积MCAO手术7 2 h，用TTC染色观察比较各组大鼠脑梗死体积,与单纯MCAO组相比,经过RIPC处理的大鼠,其脑梗死体积显著减小(P0.01,Fig.2)。RIPC+ShamRIPCMCAO/RMCAO/R200a150100b500ShamRIPCMCAO/RRIPC+MCAO/RABFig.2 Degree of cerebral infarction in rats.A:Representative micrographs of TTC-stained brain sections of rats.B:Infarct volumequantitation.“P0.01 us Sham group,bP0.01 s MACO/R group.3.远隔缺血预适应增加脑缺血模型大鼠皮质HIF-1和VEGFmRNA表达HIF-1是调节细胞缺氧适应的关键转录因子，VEGF是调节血管生成的重要分子,缺血性疾病可以引起HIF-1/VECF信号通路的激活。与单纯MCAO/R组相比,RIPC处理的大鼠皮质中HIF-1和VECF表达明显上调（P0.05,Fig.3）。讨论由于大多数缺血性卒中（约8 0%）发生在大脑中动脉所支配的脑区，许多动物卒中模型的建立都集中在该动脉上12 。MCAO的腔内栓塞模型涉及将线栓插人颈外动脉并将其向前穿入颈内动脉，直到尖端阻塞大脑中动脉的起始部，导致血流停止并3442023年5月第39 卷第3期神经解部学杂志，3.0HIF-1bVEGFb2.52.0aa1.51.00.50.0ShamRIPCMCAO/RRIPC+MCAO/RFig.3 The expression of HIF-1 and VECF mRNA in cortex ofrats.aP0.05us Sham group,bP0.05us MACO/Rgroup.随后在大脑中动脉所供应脑区发生脑梗死。该技术可用于永久性或暂时性缺血模型。如果在一定时间间隔（30 min、1h 或2 h）抽出栓塞线栓，则实现再灌注,即为MCAO/R模型；如果线栓阻塞2 4h,则为永久性脑缺血模型。这种方法不需要开颅，对颅内的压力和温度等影响较小，已成为模拟大鼠局灶性脑缺血最常用的模型13-15。本研究中，利用线栓阻塞大鼠大脑中动脉，成功制备了大鼠MCAO/R模型。术后48 h,通过神经功能评分可以观察到MCAO/R模型大鼠神经功能严重受损，通过TTC染色发现左侧大脑梗死明显，RIPC不直接作用于靶器官，而是在其他非重要器官进行，避免了对重要器官（如脑和心脏）直接进行预适应可能引起的缺血风险16 。研究人员很早就发现RIPC对远隔器官具有保护作用，并将这一现象应用于临床，比如在器官移植前进行RIPC处理，可以增加移植器官的成功率17 。尽管进行了深入的研究，但对RIPC介导的机制仍缺乏了解。不同的研究表明，除了神经源性通路和全身抗炎反应外，RIPC刺激释放到体循环中的一些因子可能在将保护信号传递到远端靶组织中发挥关键作用18 HIF-1是一种转录因子,在炎症、能量代谢、细胞凋亡等多种生理和病理条件的调控中发挥重要作用(19.0。HIF-1在缺氧/缺血后其表达迅速被诱导,通过调节红细胞生成、血管生成、糖酵解和儿茶酚胺代谢等重要过程,在多种疾病中发挥重要作用。最近的研究表明,缺氧刺激机体细胞分泌HIF-1,发挥神经保护作用，促进神经功能恢复，其中VEGF是刺激血管生成、维持血液供应、参与神经可塑性和脑神经功能恢复的下游靶基因21,22HIF-1是血管生成的主要调节因子，可调节许多下游靶基因的表达（如VECF）2 3。我们研究证明,RIPC可以促进大鼠脑组织中HIF-1和VEGF的表达。综上所述,我们的研究结果显示RIPC对大鼠缺血性脑卒中具有保护作用，并表明其潜在机制可能涉及HIF-1/VEGF信号通路。作为一种转录因子，HIF-1可以调节多种下游基因的表达，具体哪些基因参与了RIPC的保护作用还有待进一步的研究。参考文献1 Zhao Y,Zhang X,Chen X,et al.Neuronal injuries in cerebral in-farction and ischemic stroke:From mechanisms to treatment(Re-viewJ.Int J Mol Med,2022,49(2):15.D0I:10.3892/ijmm.2021.5070.2 Hosogai M,Takeda M,Maeda 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