狭叶白蜡秋季叶片呈色生理变化研究.pdf
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1、第 46 卷第 4 期2023 年 7 月河 北 农 业 大 学 学 报JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITYVol.46 No.4Jul.2 0 2 3狭叶白蜡秋季叶片呈色生理变化研究王燕龙,车晓雨,李彦慧,王金鑫,王纪明(园林与旅游学院,河北农业大学,河北 保定 071000)摘要:为明确狭叶白蜡树种秋季叶片呈色变化的生理机制,于绿叶期、红紫叶期、落叶前期对狭叶白蜡采样进行生理机制对比研究,测定其在秋季叶色变化过程中的叶色参数、色素含量、抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统、氮含量及相关酶活性、渗透调节物质含量、营养元素含量及 PAL、PPO、POD 酶活性
2、等指标,探究狭叶白蜡叶片在转色过程中的生理差异,阐明狭叶白蜡呈色的生理机制,为彩叶植物呈色机理的研究及狭叶白蜡的推广应用提供重要的理论依据。关 键 词:狭叶白蜡;叶片呈色;生理指标中图分类号:S718.3 开放科学(资源服务)标识码(OSID):文献标识码:AResearch on physiological changes of leaf coloration in autumn of Fraxinus angustifoliaWANGYanlong,CHEXiaoyu,LIYanhui,WANGJinxin,WANGJiming(College of Landscape Architect
3、ure and Tourism,Hebei Agricultural University,Baoding 071000,China)Abstract:To clarify the physiological mechanism of leaf discoloration in autumn,a comparative study was conducted on the physiological mechanism of Fraxinus angustifolia leaf sampling at the green leaf stage,red and purple leaf stage
4、 and early deciduous stage.The leaf color parameters,pigment content,ascorbate-glutathione circulatory system,nitrogen content,related enzyme activities,osmotic regulatory substance content and nutrient element content were measured during the leaf color change process in autumn to explore the physi
5、ological differences in the leaf color change process and clarify the physiological mechanism of leaf color.It provided important theoretical basis for the study on the mechanism of coloration of colored-leaf plants and the popularization and application of F.angustifolia.Keywords:Fraxinus angustifo
6、lia;leaf coloration;physiologic index收稿日期:2023-05-01基金项目:河北省教育厅重点项目(ZD2022009);国家重点研发计划项目(2020YFD1000700);留学人员资助项目(C20200334).第一作者:王燕龙(1988),男,河北保定人,博士研究生,主要从事风景园林研究.E-mail:通信作者:李彦慧(1971),女,河北保定人,博士,教授,主要从事森林培育研究.E-mail:本刊网址:http:/文章编号:1000-1573(2023)04-0055-10DOI:10.13320/ki.jauh.2023.0059彩叶植物,是指在一
7、定季节或常年叶片呈现稳定的非绿色的、有明显观赏价值的植物1。与花色的重要性一样,叶色也是植物重要的观赏性状2。彩叶植物体内色素含量受特定因素的影响而发生变化,尤其是类胡萝卜素或花青素苷与叶绿素的比例变化导致叶片呈现红色或黄色3。发达国家从事彩叶植物的栽培与应用已有百年以上的历史。在美国、加拿大等国家,彩叶树种的种植面积可达到树木总量的 30%以上。色素主要有 3 大类:一为叶绿素类,主要有叶56第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报100 株,狭叶白蜡接穗采自衡水市红旗大街的行道树,接后进行正常养护管理。于 2019 年 10 月底选取长势正常、没有病虫害的狭叶白蜡 9 株,3 株为1 重
8、复并分别做好标记。10 月 31 日、11 月 10 日、11 月 20 日分别于狭叶白蜡的绿叶期(stage-1)、红紫叶期(stage-2)、落叶前期(stage-3)于上午8 点到 9 点间取东、西、南、北方向当年生新梢中上部羽状复叶的中部功能叶片 72 片,每次每树种 3次重复(图 1)。注:从左到右依次为绿叶期(10 月 31 日采集);红紫叶期(11 月 10日采集);落叶前期(11 月 20 日采集)。图 1 3 个时期狭叶白蜡叶片采样示例Fig.1 F.angustifolia leaves sampling of 3 stages1.2 试验方法1.2.1叶色参数的测定 用色
9、差计 CR-400 对狭叶白蜡、秋紫白蜡、小叶洋白蜡叶色进行测定,记录L*、a*、b*的值,其中 L*值由小变大表示由暗转亮,a*值由负转正表示由绿色转向红色,b*值由负转正表示由蓝色转向黄色。1.2.2 色素含量的测定 色素含量采用丙酮乙醇混合液法测定。取新鲜植物叶片洗净剪碎混匀,称取 0.2 g,共 3 份,加入少量碳酸钙和石英沙研成匀浆,放入10 mL 丙酮和无水乙醇等量混合液中,用黑塑料袋罩住,至暗处,24 48 h 后,待样品变白即可测定。吸取上液 1.5 mL,再加入 3 mL 丙酮和无水乙醇混合液后,在波长 663、645、470 nm 下测定吸光值。1.2.3 花青苷含量测定
10、采用 0.1 mol/L 盐酸乙醇浸提法,将新鲜叶片剪碎混匀后称取 0.1 g 于盛有 10 mL 0.1 mol/L 盐酸乙醇溶液的试管中暗提取 24 h,过滤后用紫外可见分光光度计测定 OD535值,将每克鲜重在 10 mL 提取液中改变 0.1 个 OD 值当作 1 个色素单位。1.2.4 抗坏血酸-谷胱甘肽(ASA-GSH)循环中抗氧化物质含量及酶活性的测定 ASA、DHA、GSH、GSSG 酶液提取:取叶片 0.2 g,放入 5 mL 的 10%TCA 充绿素 a、叶绿素 b;二为类胡萝卜素类,主要有类胡萝卜素和叶黄素;三为类黄酮类色素,又称为花色素苷。不同的色素在外观上表现为不同的
11、颜色,普通叶片中叶绿素比类胡萝卜素多,所以叶片总是呈现绿色。研究表明,类黄酮、花青素和类胡萝卜素的组合可增加叶片颜色的多样性。银杏(Ginkgo biloba L.)、金钱松(Pseudolarix amabilis)等叶片含有较多的类胡萝卜素而呈现黄色;鸡爪槭(Acer palmatum Thunb)、三 角 枫(Acer buergerianum Miq)等花青素含量升高时呈现红色4-5。雁来红(Amaranthus tricolor)秋季叶片由紫色转变为鲜红色也是由于细胞衰老、叶绿素减少,使花青素的颜色显示出来的结果6。类胡萝卜素和花青素也在光系统的光保护中起着重要的作用,这有利于植物适
12、应环境并在叶片衰老期间维持其内部机制的正常运行。研究认为,可溶性糖、PAL、PPO、POD 等在不同程度上影响着花色素苷的合成与降解7。狭叶白蜡(Fraxinus angustifolia)是木犀科白蜡属植物,落叶乔木,原产欧洲西南部、非洲北部,树形优美,秋季叶色呈现紫红色,可作行道树或者与其他园林树木相搭配组成园林绿地,观赏价值极佳8。但是,有关于狭叶白蜡的研究还处于起步阶段,尤其是叶色变化过程中的生理指标鲜有报道。因此,本研究以狭叶白蜡为试验材料,测定其在秋季叶色变化过程中的叶色参数、色素含量、抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统、氮含量及相关酶活性、渗透调节物质含量、营养元素含量及 PAL、PPO
13、、POD 酶活性等指标,探究狭叶白蜡叶片在转色过程中的生理差异,阐明狭叶白蜡呈色的生理机制,为彩叶植物呈色机理的研究及狭叶白蜡的推广应用提供重要的理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料试验地位于河北省保定市易县河北省洪崖山林管局七里亭林场苗圃(东经 115 24 12 115 31 06和北纬 39 28 31 39 33 28 之间)。该地区四季分明,年平均气温 11.5,极端高低温分别为 41 和-23,年均降水为 616.0 mm,年均蒸发量为 1 162.7 mm。2015 年 3 月份在七里亭林场苗圃内以 3 年生的小叶洋白蜡为砧木进行狭叶白蜡的插皮接,嫁接57第 4 期分研磨,在
14、 4,12 000 r/min 转速下离心 15 min,取上清液为酶提取液。ASA、DHA、GSH、GSSG的测定方法参照李忠光9。APX、GR、DHAR、GPX 酶 液 提 取:取 0.2 g 叶 片,加 入 5 mL 预 冷 的 PBS(pH 7.8,含 0.2 mmol/L EDTA,2%PVP,2 mmol/L ASA),冰浴研磨,4,12 000 r/min 下离心20 min。APX、GR、DHAR测定方法参照Ma10。GPX 测定方法参照孟庆瑞11,并做部分改进。取 0.2 mL 酶液,加入 2.7 mL 25 mmol PBS(pH7.8,含 0.1 mmol EDTA),0
15、.2 mL 20 mmol/L H2O2,0.2 mL 1%愈创木酚,以 PBS 缓冲液为对照,记录470 nm 下的 OD 值变化。1.2.5氮含量和相关酶活性的测定 硝态氮含量测定:10 mL 去离子水放入 0.3 g 剪碎的叶片,沸水浴 30 min,静置至室温,定容到 25 mL。取上述提取液 0.1 m,与 0.4 mL 5%水杨酸-硫酸溶液混匀后静置20 min,加入 8%NaOH 溶液 9.5 mL 后,测定 410 nm 下 OD 值。铵态氮含量测定:取 0.3 g 叶片加入 5 mL 10%醋酸研磨成匀浆后于 4,10 000 r/min 转速下离心 10 min,将上清液用
16、蒸馏水稀释至 100 mL,取出 2 mL 稀释液与 3 mL 60 mmol/L 茚三酮和 0.1 mL 1%抗坏血酸摇匀后沸水浴 15 min,冷却至室温后加入无水乙醇至 10 mL,在 580 nm 下测定 OD 值。硝酸还原酶活性的测定方法参照施晟璐试验方法12。GS、GDH 活性的测定方法参考 Debouba 试验方法13,GOGAT 活性的测定方法参考王伟香试验方法14。1.2.6 游离脯氨酸的测定 游离脯氨酸采用磺基水杨酸提取,分光光度法测定。待测液的制定:称取 0.2 g 左右的幼苗叶片,用3%磺基水杨酸溶液提取研磨,使最终磺基水杨酸体积为 5 mL,匀浆液转入玻璃离心管中,在
17、沸水浴中浸提 10 min,冷去后,以 3 000 r/min 离心 10 min,取上清液待测。样品测定:吸取 2 mL 上清液于试管中,再加入 2 mL 水,2 mL 冰乙酸和 4 mL 2.5%的酸性茚三酮溶液,置于沸水浴中显色 l h,冷却后加入 4 mL甲苯,用手充分振荡,以萃取红色物质,静置后,吸取甲苯层于 722 分光光度计(Thermo ScientificTM GENESYS 10S)于 520 nm 波长进行测定。标准曲线的绘制:配置浓度为 1 10 g/g,10 个系列的游离脯氨酸标准溶液,吸取标准液 2 mL(参比液 2 mL 水)和 2 mL 3%磺基水杨酸溶液代替样
18、品测定 2 mL 上清液和 2 mL 水,按上述程序进行显色,萃取和比色,最后绘制标准曲线。根据标准曲线求得样品的游离脯氨酸含量。1.2.7 可溶性糖的测定 采用蒽酮比色法测定叶片中可溶性糖的含量,用可见分光光度计(Thermo NanoDrop 2000c)进 行 测 定。酶 液 提 取 方 法 同MDA。测定时取 5 mL 考马斯亮蓝和 0.1 mL 酶液混合后摇匀,静置 2 5 min 后,以 pH7.8 磷酸缓冲液调零,在 595 nm 波长下测定相关数据。称取叶片 0.1 g,研磨成浆并定容至 10 mL,沸水煮 10 min,离心一定时间后,取其上清液。用移液枪加入提取液0.5 m
19、L和1.5 mL蒸馏水,再加葱酮-乙酸乙酯试剂 0.5 mL,再加入 5 mL 浓硫酸,充分摇匀。采用葱酮比色法,在 630 nm 波长下测定相关数据。根据标准曲线求出标准方程,再根据 630 nm波长下吸光度值分别计算出样品中可溶性糖的含量(g)。1.2.8 可溶性蛋白的测定 采用考马斯亮蓝 G-250染色法测定叶片中可溶性蛋白质的含量。酶液提取方法同 MDA。测定时取 5 mL 考马斯亮蓝和 0.1 mL酶液混合后摇匀,静置 2 5 min 后,以 pH 7.8 磷酸缓冲液调零,在 595 nm 波长下测定其值。1.2.9 营养元素的测定 将新鲜材料用去离子水洗净,用分析滤纸拭干。放在 8
20、0 90 的烘箱中鼓风烘 15 30 min,然后降温在 60 70 条件下烘干至恒重。将干样用研钵研碎,过 0.5 mm 塑料筛,装入纸袋放入干燥器内备用。称取样品 0.5 g 左右于消煮管中,加混酸(浓 HNO3HCLO5=51)15 mL,在管口放上弯颈小漏斗,在远红外消煮炉中加热,消煮至冒白烟,液体变为无色透明为止。然后转到 50 mL 容量瓶中。全氮、磷、钾、钠、钙、镁的测定参照林业行业标准 LY/T 1271-1999;全铁、锰、铜、锌的测定参照林业行业标准 LY/T 1270-1999。1.2.10 PAL 活性的测定 称取处理干净的新鲜叶片0.1 g 于预冷研钵,用 5 mL
21、0.1 mol/L pH8.8 内含巯基乙醇 2 mmol/L 的硼酸缓冲液冰浴研磨后冰冻离心20 min(12 000 r/min),将上清液转入干净带塞试管,于 0 4 冰箱中贮存作备用酶液。另外在别的试管中吸取 l mL 0.02 mol/L 的苯丙氨酸和 2 mL 0.1 mol/L pH8.8 的硼酸缓冲液混合(对照管则用 王燕龙,等:狭叶白蜡秋季叶片呈色生理变化研究58第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报1 mL 硼酸缓冲液替代苯丙氨酸反应底物),于 40 水浴锅中保温 30 min 后加入 0.1 mL 酶液混合,恒温反应 30 min 后加入 0.2 mL 6 mol/L
22、 HCl 终止反应。取反应液于 290 nm 波长下测定其吸光度。最后以每小时吸光度 OD290增加 0.01 为 1 个酶活性单位(U),计算 PAL 的活性大小。1.2.11 PPO 活性的测定多酚氧化物酶(PPO)活性测定。取 0.5 g 叶片,剪碎后放入预冷的研钵中,加 入 5 mL 0.05 mol/L PBS 缓 冲 液(pH6.8,内含 1%PVP),在冰浴中研磨匀浆。10 000 r/min离心 30 min,上清液即为粗酶液。反应体系中有 1.5 mL PBS,1.0 mL 0.1 mo/L 联苯二酚,35 保温10 min,立即加酶液 0.5 mL,测定 420 nm 处吸
23、光度在 2 min 内的变化,以每分钟 OD420变化 0.01 为1 酶活性单位。1.2.12 POD 活性的测定酶液的提取:取洗净的新鲜材料 0.15 g 置于冰浴的研钵中,先加入 2 mL pH7.8 的磷酸缓冲液,充分研磨至无粗纤维为止导入离心管,再用 3 mL 磷酸缓冲液洗净研钵转入离心管中,在 4,离心 20 min,取上清液用于保护酶活性的测定。SOD 活性测定采用氮蓝四唑(NBT)光还原法。取透明度好、质地相同的 15150 mm 试管 5 支,以 3 支作为测定管、2 支作为对照管。向 5 支试管中加入下列试剂:50 mmol/L 磷酸缓冲液 1.5 mL、130 mmol/
24、L Met 溶液 0.3 mL、750 mol/L NBT 溶液0.3 mL、100 mol/L EDTA-Na2 液 0.3 mL、20 mol/L 核黄素 0.3 mL,然后再向 2 支测定管中加入酶提取液 0.1 mL,对照管不加酶液。最后向 2 支测定管加入蒸馏水 0.5 mL,对照管中加入蒸馏水 0.6 mL。混匀后,给对照管中的 1 支罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光,与其他各管同时置于 4 000 lx 日光灯下反应 20 min。反应结束后,用黑布罩上试管以终止反应,以遮光的对照管作为空白调零,在 560 nm 波长下测定各管的吸光度,并计算 SOD 活性。POD 活性测定采
25、用愈创木酚法15。采用 2.91 mL pH7.0 磷 酸 缓 冲 液(10 mmol/L)、50 L 愈 创 木酚(20 mmol/L)、200 L 酶液和 20 L 过氧化氢(40 mmol/L)作为反应体系溶液。取 3 mL 反应液,加入上述测定 SOD 活性的酶提取液 20 L 于小管中,充分混合后,充分混匀后置于 34 恒温水浴中 3 min,然后加 20%三氯乙酸 20 L 终止反应。用分光光度计(Thermo ScientificTM GENESYS 10S)测定在 470 nm 波长下吸光度,计算 POD 活性。CAT 活性测定:取 50 mL 三角瓶,2 支作为对照,测定瓶加
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