小麦衔接蛋白TaAP2-μ基因的克隆与功能分析.pdf
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1、山东农业大学学报(自然科学版),2023,54(3):344-351VOL.54 NO.3 2023Journal of ShandongAgricultural University(Natural Science Edition)doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2023.03.002小麦衔接蛋白小麦衔接蛋白 TaAP2-基因的克隆与功能分析基因的克隆与功能分析李天天,王如凯,王连慧,孙 琪,周淑梅*山东农业大学 生命科学学院,山东 泰安 271018摘摘 要要:衔接蛋白(Adaptor protein,AP-2)是细胞内吞途径重要的蛋白之一,在披网格蛋白小泡形成中
2、与受体的细胞质结构域相互作用,起衔接作用,参与从细胞质膜形成的披网格蛋白的组装。实验从小麦济麦 44 克隆到了 TaAP2-基因,基因 ORF 长度为 1 317 bp,编码 438 个氨基酸,蛋白分子量为 49 kD。亚细胞定位结果显示该基因位于细胞质和细胞核。PlantCARE 启动子元件分析表明,TaAP2-基因的启动子序列包括参与光响应模块的顺势作用元件(ATCT-motif)、光反应元件(Sp1)、光调控元件(GATA-motif)、参与茉莉素内酯反应(CGTCA-motif 和 TGACG-motif)和玉米醇蛋白代谢(O2-site)的顺式作用调控元件等。qRT-PCR 结果表明
3、,该基因在小麦的茎中含量最高,其次是叶,根中最少。并且该基因受到多种激素如 MeJA、SA、ABA 等处理的诱导表达,并且该基因对这三种激素都有不同程度的响应,说明可能参与激素调控的多项生理过程。该结果为进一步深入研究 TaAP2-的生物学功能奠定了基础。关键词关键词:小麦;衔接蛋白;基因克隆;功能分析中图法分类号中图法分类号:Q812文献文献标识码标识码:A文章编号文章编号:1000-2324(2023)03-0344-08Cloning and Functional Analysis of TaAP2-Gene of AdaptorProtein from WheatLI Tian-tia
4、n,WANG Ru-kai,WANG Lian-hui,SUN Qi,ZHOU Shu-mei*College of Life/Shandong Agricultural University,Taian 271018,ChinaAbstract:Adaptor protein,AP-2,is one of the most important proteins in cell endocytic pathway,which plays a bridging roleinteractingwiththecytoplasmicdomainofthereceptorintheassemblyof
5、clathrinvesicles,andparticipatingintheassemblyofclathrinformedfromthecytoplasmicmembrane.Wecloned TaAP2-genefromwheat Jimai44,whoselengthof ORFis1 317bp,coding438amino acids and the molecular weight of the protein is 49 kD.We found that TaAP2-is located in the cytoplasm and nucleus bysubcellular loc
6、alization.Andwe also found thatTaAP2-geneconsists of cis-actingregulatory elementsinvolvinglight responsiveness(ATCT-motif),light responsive element(Sp1),light regulatory element(GATA-motif),MeJA-responsiveness(CGTCA-motif andTGACG-motif)and zein metabolism regulation(O2-site)by online software Plan
7、t CARE.We detected that the stems of wheat has thehighest expression level of gene and roots has the lowest level by qRT-PCR.Moreover,the expression of the gene can be induced byMeJA,SA,ABA and the gene responds to the three hormones in different degrees,indicating it may be involved in a variety of
8、physiologicalfunctionsthathormonesregulates.TheresultsbuiltafoundationforfurtherbiologicalstudyofTaAP2-.Keywords:Wheat;adaptor protein;gene clone;functional analysis小麦是世界三大粮食作物之首,是全球约 40%人口的主要食粮。我国的小麦种植面积和小麦产量都高于其他国家,2022 年小麦种植面积为 2 354.51 亿 m2,小麦产量 13 772.3 万 t1。小麦的生长常常会受到病虫害的侵染,严重影响小麦的质量和产量。赤霉病是影响
9、小麦质量和产量的世界性病害之一,造成小麦产量的损失在全球病害中占第二位2。被病菌侵染的小麦籽粒会产生以 DON(脱氧雪腐镰刀菌烯醇,deoxynivalenol)为主的毒素3,威胁人畜健康。当植物受到病虫害的侵染时,会产生相关的信号分子进行相应,经过信号转导,激发对应抗病基因表达,最终抵御病原菌的入侵。常见的信号分子有茉莉酸(JA)4,水杨酸(SA)5,乙烯(ET)6等。网格蛋白介导的内吞作用(Clathrin-Mediated Endocytosis,CME)是指胞外物质通过进入网格蛋白包被的囊泡进入胞内。有研究证明,网格蛋白介导的内吞作用可以影响细胞的信号转导、生长发育、响应外界刺激、营养
10、物质获取等过程7,8。Dhonukshe P 发现CME 与生长素运输的调控有关9,Irani NG收稿日期收稿日期:2022-12-25修回日期修回日期:2023-02-14基金项目基金项目:国家自然科学基金:小麦网格轻链蛋白基因 TaCLC1 参与调控赤霉病抗性的分子机制研究(31801270);山东省自然科学基金:小麦 TaCLC1 参与调控赤霉病抗性的功能分析(ZR2019MC006)第第 1 作者简介作者简介:李天天(2003-),女,本科生在读,研究方向:细胞生物学.E-mail:LITT*通讯作者通讯作者:Author for correspondence.E-mail:第 3
11、期李天天等:小麦衔接蛋白 TaAP2-基因的克隆与功能分析345发现 CME 与油菜素类固醇(BR)信号转导有关10。Sharfman M 和 Adam T 发现 CME 与病原体反应有关11,12,衔接蛋白(Adaptor Protein)是指在网格蛋白组装过程中衔接网格蛋白与受体胞质结构域的一类蛋白复合体,可为大分子结构复合物的合成提供支架,参与细胞中活化胞内信号的整合和传递。至此,在植物中共发现了 5 种 AP 复合体,分别为 AP-1、AP-2、AP-3、AP-4、AP-513,其中AP-2 是从细胞质膜形成网格蛋白过程的重要物质。AP-2 复合体是异源四聚体,由两个大亚基(和)、一个
12、中间亚基()和一个小亚基()组成。其中中间亚基负责货物蛋白的识别和分拣,NPXY、YXX和 dileucine motifs 可以被它识别(N 代表天冬酰胺,P 代表脯氨酸,Y 代表酪氨酸;X 代表任意氨基酸;代表疏水性氨基酸)14,这些信号存在于货物蛋白的胞质端。有研究表明亚基所在AP-2 复合体在细胞生长、信号传导以及响应对外界环境的刺激等多种生物进程都发挥了重要作用7,8。植物吸收营养物质的部位主要是根和叶,主要是细胞的主动与被动吸收,由于细胞膨压的存在,长期以来人们认为植物不通过内吞作用吸收营养物质。对内吞作用的研究大多以动物为研究对象。但膨压不现已有研究表明细胞会影响植物细胞内吞作用
13、的发生15。而且实验数据表明,CME 的调节机制在植物和哺乳动物之间是保守的16。并且与内吞作用相关物质在植物细胞中被发现,因此其在植物细胞中的功能也越来越被重视。Bashline L 等发现在拟南芥中纤维素合成酶的合成的过程中,AP-2 的亚基发挥了重要的运输作用17,Kim SY 等发现在拟南芥中 AP-2 对花粉的活力以及产量和雄蕊花丝和花粉管的伸长率有重要影响,而且施加外源生长素可以部分挽救,可推测 AP-2 与生长素的信号转导有关18。但截至目前为止,对于植物细胞内 AP-2 蛋白的研究大部分限制于拟南芥这一模式植物中,在其他物种中的研究较少。亚基的功能在其他方面也没有被完全阐述。本
14、实验以小麦济麦 44 为材料,分离克隆得到了小麦 TaAP2-基因,对其进行了生物信息学特点分析,并研究了该基因对多种激素处理的响应分析,为后期该基因提供的功能探究思路并打下基础。1材料与方法材料与方法1.1实验材料实验材料供试材料为小麦品种济麦 44,小麦种子由本实验室保存种植。实验中作用的菌种为农杆菌GV3101、超表达载体超表达载体 pROK由实验室制备并保存。试剂 T4 DNAligase,以及各类限制性内切酶均从 Thermo Fisher 公司购买;2mix、DNA Marker、购买于 Vazyme 公司;胶回收试剂盒、反转录盒试剂等购买于天根生化有限公司;荧光染料混合液 SYB
15、R、用于 qRT-PCR 的 96 孔板,购买于 Roche 公司。1.2实验方法实验方法1.2.1 小麦 TaAP2-基因的克隆1.2.1.1 RNA 的提取:使用常用的 Trizol 法提取植物总 RNA。1.2.1.2 cDNA 的合成 以上一步提取的 RNA 为模板,采用试剂盒法,反转录反应体系如下:5FastKing-RT Supermix4.0 LTotal RNA50 ng2 gRNase-Free ddH2OUp to 20 L将 cDNA 产物置于-20 存储备用。1.2.1.3 基因扩增 Ensembl plants(http:/plants.ensembl.org/ind
16、ex.html 中下载 TaAP2-基因序列。并设计一对引物,序列为:2F-MU:GTCAAGGGTGGTGGTCCCA2R-MU:CGCCATTTTTCTTGGTCACTAACACC以上一步获得的 cDNA 作为模板,进行 PCR 扩增,本次实验具体反应如下:cDNA 模板1.0 LdNTP1.0 L引物-F1.0 L引物-R1.0 L10PCR Buffer2.5 LTaq 酶0.2 LddH2OUp to 25 L346山东农业大学学报(自然科学版)第 54 卷然后用琼脂糖凝胶电泳检测目的基因扩增结果。1.2.1.4 胶回收目的基因片段 采用试剂盒法进行对上一步中目的基因片段胶回收。1.
17、2.2 目的基因与克隆载体的连接 连接基因片段与克隆载体 pROKII,加入物质如下:组分加入量目的基因片段4.5 LpROKII simple vector0.5 LSolution I5 L混匀后放置于 16 金属浴中过夜连接目的基因与克隆载体。1.2.3 转化大肠杆菌感受态细胞 使用实验室常用方法将构建好的载体转入大肠杆菌中并培养。1.2.4 菌液 PCR 鉴定 以培养基长出来的菌落为模板进行菌液 PCR,实验反应体系如下:模板1 L引物-F0.8 L引物-R0.8 L2Mix Taq 酶10 LddH2O7.4 L然后用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。之后将信号强度大对应的菌株挑点加
18、入到 20 mL 相应抗性 LB 液体培养基,培养过夜。1.2.5 小量提取质粒 使用试剂盒法提取质粒。1.2.6 质粒 DNA 的酶切 用相对应的酶双酶切目的基因和表达载体,酶切体系如下:质粒16 L核酸内切酶 12 L核酸内切酶 22 L10酶切 buffer4 LddH2OUp to 40 L将上述溶液混匀后放置于金属浴中反应 1.52 h。1.2.7 目的基因与表达载体连接 将目的基因与表达载体连接,加入体系如下目的片段3 L表达载体5.85 LT4 连接酶0.15 LT4 连接酶 buffer1 L充分混匀后,室温条件下连接 2 h。再将连接产物进行转化农杆菌、菌液 PCR、提取质粒
19、酶切鉴定、测序检测。1.2.8 转化农杆菌 将构建好的表达载体转化进入农杆菌感受态细胞。1.2.9 生物信息学分析 在线网站 EnsemblPlants 分析基因和启动子序列。利用在线网站 PlantCARE对 TaAP2-基因的启动子区域进行顺式作用元件分析。利用 NCBI-ORF finder 工具获取 TaAP2-基因的开放阅读框和氨基酸序列;利用 NCBI 网站中的 Conserved Domain database 数据库分析蛋白质的保守结构域;利用 NCBI 网站中的 BLAST 功能,搜索同源序列,用 MEGA 件对不同物种间 TaAP2-构建系统进化树;利用 Prabi 网站对
20、蛋白质二级结构进行预测。利用 Swissmodel 网站对蛋白质的三级结构进行预测。利用在线网站 Expasy-Prot-Param 对该蛋白基本理化性质进行分析。1.2.10 亚细胞定位(1)活化之前保存的pROKII-GFP、pROKII-TaAP2-GFP表达载体的弄干GV3101菌种,吸取 200 L 菌液加入到 10 mL 含有相应抗性的 YEP 培养基中,28 下震荡培养过夜;(2)吸取 500 L 上一步活化的菌液于含有相应抗性的 YEP 培养基中,28 下培养至 OD600值到 1.5。(3)使用 4 离心机 5 000 rpm 离心 10 min,收集菌体。用预先配置好的 M
21、MA 重悬沉淀菌体,使重悬液体 OD600=1.0,黑暗条件下处理 5 h;。(4)将含上一步获得的重悬液与溶液 P19 进行混合,注射烟草,然后在温室中培养 34 d。(5)使用双光子共聚焦显微镜观察。MMA 配方(10 mL):第 3 期李天天等:小麦衔接蛋白 TaAP2-基因的克隆与功能分析3471 M MES0.1 mL1 M MgCl20.1 mL0.2 MAS10 LddH2OUp to 10 mL1.2.11 TaAP2-基因组织表达特异性(1)分别提取小麦根、茎、叶,提取 RNA。(2)利用上述引物和方法合成 cDNA。(3)以 cDNA 为模板进行荧光定量 PCR,本次实验具
22、体反应如下:cDNA 模板1.0 LSYBR7.5 L引物-F1.0 L引物-R1.0 LDdH2O5.0 L1.2.12 TaAP2-对激素响应分析 将小麦幼苗移至营养基质中,培养条件为 25,16 h 光照 8 h 黑暗,连续培养大约 28 d,分别喷施 1 mM SA、50 M MeJA 和 100 M ABA,再分别处理后 0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 取样,提取 RNA,利用上述方法进行荧光定量 PCR。2结果与分析结果与分析2.1TaAP2-基因的克隆基因的克隆我们根据数据库 EnsemblPlant(http:/plants.ensembl.org
23、/index.html)查到基因序列并据此设计引物:2F-MU:GTCAAGGGTGGTGGTCCCA2R-MU:CGCCATTTTTCTTGGTCACTAACACC基因扩增结果见图 1,条带大小符合预期,测序显示该片段长度为 1 317 bp。通过 Ensemble Plant网站分析可知,小麦衔接蛋白 TaAP2-的开放阅读框长度为 1 317 bp,编码 438 个氨基酸,其中缬氨酸含量最高,组氨酸含量最低。图图 1 TaAP2-的的 PCR 电泳结果电泳结果Fig.1 PCR result of TaAP2-M:DNAMarker 5kP1、P2:cDNA 扩增产物M:DNA Mark
24、erP1,P2:cDNAAmplification products图图 2 TaAP2-编码的蛋白中氨基酸含量分布编码的蛋白中氨基酸含量分布Fig.2 Distribution of amino acid content in proteins encoded by TaAP2-2.2TaAP2-基因的生物信息学分析基因的生物信息学分析2.2.1 蛋白保守序列分析 利用在线网站 NCBI 中的 Conserved Domain Database 功能对 TaAP2-蛋白的保守结构域进行分析,结果如图 3 所示。从图中可以看出,第 6 到 144 个氨基酸是保守序列,属348山东农业大学学报(
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