脑泰通组方对局灶性脑缺血再灌注大鼠模型的影响及保护机制.pdf
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1、基金项目:国家重点研发计划项目();国家自然科学基金项目();湖南省自然科学基金项目(),湖南省卫生健康委员会科研计划课题();湖南省中医药科研计划项目();湖南省教育厅优秀青年项目()作者简介:乐金海(),男,硕士,主治医师,研究方向:中医药防治脑血管疾病及危急重症,:通信作者:林湘东(),男,博士,主治医师,研究方向:中医药防治内分泌疾病,:脑泰通组方对局灶性脑缺血再灌注大鼠模型的影响及保护机制乐金海林湘东向茗张强胡哲(湖南中医药大学第一附属医院,长沙,;湖南中医药大学中医诊断研究所,长沙,)摘要目的:观察脑泰通组方对局灶性脑缺血再灌注大鼠模型的影响及保护机制。方法:构建局灶性脑缺血再灌注
2、大鼠模型,成模后随机分为模型对照组、阳性药物组、中药组、联合用药组,另选取健康斯泼累格多雷()大鼠作为假手术组。观察并评估各组大鼠的美国国立卫生研究院卒中量表()评分、脑组织含水量、脑梗死体积百分比,免疫组织化学法检测脑组织 相关 蛋白()、细胞淋巴瘤 ()的平均光密度值,蛋白质免疫印迹法、实时定量 ()检测脑组织叉头框转录因子 ()基因、低氧诱导因子 ()、核因子 ()、脑源性神经营养因子()蛋白及 的表达水平。结果:与假手术组比较,模型对照组 评分,脑组织含水量,脑组织缺血体积百分比,脑组织 、蛋白和 的表达水平,、平均光密度值以及 值均显著升高(均 );与模型对照组比较,药物干预各组的
3、评分、脑组织含水量、脑梗死体积百分比、平均光密度值、值、脑组织 蛋白和 的表达水平显著降低(均 ),其中联合用药组的降低程度最大(均 ),平均光密度值,脑组织 、蛋白和 的表达水平显著升高(均 ),其中联合用药组的升高程度最大(均 )。结论:脑泰通组方能有效保护局灶性脑缺血再灌注大鼠模型脑组织损伤,改善局部脑缺血,其作用机制可能与脑泰通组方调控 信号通路相关。关键词脑缺血再灌注;脑泰通组方;叉头框转录因子 低氧诱导因子 核因子 信号通路;脑缺血保护;局灶性脑缺血再灌注大鼠模型 ,(,;,):,()()()(),(),(),():,(),(),(),(),():;,;中图分类号:文献标识码:缺血
4、性脑血管疾病是致残、死亡的重要危险因素 。缺血性脑血管疾病往往发病突然,若未得到及时救治极易造成脑组织的不可逆损害,存在诸如半侧肢体功能障碍、语言障碍等后遗症,是严重威胁居民健康与生命、降低患者生命质量、增加患者不良事件风险的常见病、多发病 。现阶段缺血性脑血管疾病是医学界颇为棘手的难题,是研究者亟须攻克的临床重点,当前临床治疗本病的关键是重建脑组织血运,恢复缺血区域血液供应,改善脑组织损伤程度 。但是 等 研究显示,脑卒中患者的脑组织在重建血运之后,缺血再灌注的脑组织会发生异常凋亡事件,触发局部脑组织一系列级联效应,反而加剧缺血区域的损伤程度,形成缺血再灌注损伤。寻求治疗缺血性脑血管疾病,保
5、护脑组织缺血区域再灌注损伤的治疗方法意义重大。缺血性脑血管疾病属于中医学“中风”“卒中”等范畴 ,诸多医家对本病的病因病机及发展预后多有论述,认为“气虚血瘀,脑络受阻”是本病的基本病机,“益气活血,护脑安神”是治疗本病的基本原则 。脑泰通组方是湖南中医药大学第一附属医院治疗缺血性脑血管疾病的效方,在多年的临床运用中取得了显著、稳定的疗效,不良反应较小,但其具体作用机制仍需要进一步明确。尼莫地平是目前临床用于改善急性脑血管病血液循环的西药,目前该药联合中医药治疗脑卒中、改善脑缺血病变的研究较多,但其联合中药复方改善脑组织缺血再灌注的研究鲜有报道。本研究以前期预实验为基础,采用大脑中动脉闭塞(,)
6、模型构建局灶性脑缺血再灌注大鼠模型,基于转录因子叉头框蛋白 (,)低氧诱导因子 (,)核因子 (,)信号通路探讨脑泰通组方对局灶性脑缺血再灌注大鼠模型的影响及保护机制。材料与方法 材料 动物 只无特定病原体动物(,)级健康雄性斯泼累格多雷(,)大鼠,周龄,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物许可证 号:(湘),合 格 证 号:,实验前给予 周适应饲养,环境温度 ,湿度 ,自由摄食,实验全程按照动物伦理学标准进行(伦 理 审 批 号:)。药物脑泰通组方中药材购于湖南中医药大学第一附属医院中药房,经制剂鉴定中心鉴定合格,具体药物组成:黄芪 、当归 、赤芍 、川芎 、桃仁 、红花 、三七 、人参
7、 、地龙 。上述中药材经纯净水浸泡 后由制剂室根据人等效剂量进行水煎浓缩为浸膏剂,使其终浓度为 ,置于常温下阴凉处储存;尼莫地平(拜耳医药保健有限公司,德国,批号:)。试剂与仪器 、脑源性神经营养因子(,)、细胞淋巴瘤 (,)、相关 蛋白(,)抗体(公司,美国,货号:、);二抗(公司,美国,货号:);磷酸盐缓冲液(,)(公司,美国,货号:);电镜(徕卡公司,德国,型号:);荧光 板(,美国,型号:);电动摇床(江苏其林贝尔仪器制造公司,型号:);水平琼脂糖电泳槽(北京六一仪器厂,型号:);荧光定量 仪(,美国,型号:);电泳仪(北京六一仪器厂,型号:);转膜仪(北京六一仪器厂,型号:),其余实
8、验试剂及仪器均由实验室提供。方法 分组与模型制备参考 等 的局灶性脑缺血再灌注大鼠模型构建方法(法),具体为:随机选取 只 级 大鼠,术前禁食 ,制备尼龙绳栓结,配制 水合氯醛()。麻醉大鼠后取仰卧位颈中部术口,分离各层组织及右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉,于颈总动脉分叉近心端结扎颈外动脉并以小动物动脉夹阻断血流,于颈外动脉分叉行 形切口,将制备好的无菌尼龙绳栓结缓慢放入并收紧线结,放开小动物动脉夹,缓慢将尼龙绳栓结沿着冠状动脉经过颈内动脉放入大鼠脑内,放入约 ,感觉到存在阻力时立即停止世界中医药 年 月第 卷第 期放入线结,使线结尾端平齐冠状动脉起始处,阻断冠状动脉血流,拉紧尼龙绳,行止血
9、操作,缝合术口,单笼饲养。待大鼠苏醒后,根据美国国立卫生研究院卒中量表(,)评分法对局灶性脑缺血再灌注大鼠模型进行评价,即 评分 分的大鼠视为成模,纳入后续研究。在本研究,共死亡 只,成功造模 只。随机选取 只已成模的局灶性脑缺血再灌注大鼠,分为模型对照组、阳性药物组(尼莫地平组)、中药组(脑泰通组方组)、联合用药组(尼莫地平 脑泰通组方组),每组 只。另选取 只健康的 级 大鼠作为假手术组,仅给予同部位分离颈内、外动脉及颈总动脉,不用尼龙绳栓结。给药方法假手术组与模型对照组均予以 的 生理盐水灌胃;中药组大鼠给予脑泰通组方浸膏灌胃,给药剂量 ,次 ;阳性药物组给予尼莫地平片粉末溶于 的 生理
10、盐水灌胃,给药剂量 ,次 ;联合用药组给予尼莫地平片 脑泰通组方浸膏灌胃,剂量同前,次 。各组均连续干预 。检测指标与方法 评分测定根据 等 制定的 评分标准,在干预后、分别进行 评分测定:缓慢抓起大鼠尾部,距离实验台约 ,前爪趴于台面,轻柔推动其前肢大关节直至向前滑动 ,选择方向测试数次,脑组织未损伤大鼠在反方向可感受到抵抗,脑组织损伤大鼠则呈偏瘫状前爪屈曲。正常记为 分;前爪屈曲,抓尾试验阳性记 分;前推抵抗程度明显下降,前爪屈曲记 分;自发单侧转圈,爬行时出现偏瘫记 分。脑组织含水量测定各组大鼠在最后 次干预 后处死,完整取出脑组织,于精准天平称取脑组织湿重,后置于烘箱烘干后称取脑组织干
11、重,脑组织含水量()(脑组织湿重 脑组织干重)脑组织湿重 。脑组织缺血体积百分比测定取出完整的脑组织后以大脑冠状沟线进行切片,放入 的氯化三苯基四氮唑(,)染色液中孵育 ,健康脑组织表现为鲜红色,缺血脑组织表现为白色,借助 软件分析脑组织缺血体积百分率,脑组织缺血体积百分率()脑组织切片缺血区域面积 脑组织切片总面积 。免疫组织化学法染色根据说明书步骤进行操作:脱蜡后进行封闭,添加一抗、二抗,二氨基联苯胺(,)显色,进一步脱水、封片,随机选取个视野进行分析,用 软件计算平均光密度值(,)。蛋 白 质 免 疫 印 迹 检 测 大 鼠 脑 组 织 、蛋白表达水平提取各组大鼠脑组织总蛋白,经十二烷基
12、硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳(,)后将蛋白置于聚偏二氟乙烯(,)膜,脱脂奶粉完全封闭孵育 ,添加一抗抗体 (),(),(),(),环境下静置 ,弃去一抗,洗涤缓冲液(,)洗膜次,每次 。室温孵育二抗 ,洗涤后弃去二抗,洗膜 次,每次 。显色后以甘油醛 磷酸脱氢酶(,)作为内参,计算各蛋白的灰度比值。实时定量 检测大鼠脑组织 、和 的 表达水平提取大鼠脑组织总 ,逆转录为 ,特异性扩增 、。反应条件为 ,变性;,;,;次循环。采用 法计算各蛋白的表达量。引物序列见表。统计学方法采用 统计软件进行数据分析,其中计数资料以频数及百分率表示,计量资料采用均数 标准差(珋 )表示,组间比较采用多样本单因素
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